Analyseur d’enzymes de restriction

Analysez des séquences d’ADN avec des enzymes de restriction — effectuez des digestions simples et doubles, analysez les fragments de restriction, parcourez une base de données de plus de 60 enzymes de restriction de type II, et recherchez des sites de restriction à l’aide des codes IUPAC. Voir aussi : Analyse de séquences | Concepteur d’amorces.

Saisissez une séquence d’ADN et choisissez une enzyme de restriction pour trouver tous les sites de coupure et les longueurs de fragments obtenues.

Codes d’ambiguïté IUPAC : R=A|G, Y=C|T, M=A|C, K=G|T, S=C|G, W=A|T, H=A|C|T, B=C|G|T, V=A|C|G, D=A|G|T, N=n’importe lequel. Données d’enzymes compilées à partir de la littérature publiée et de bases de données publiques.
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction ?

Une enzyme de restriction est une paire de ciseaux moléculaires que les bactéries ont fait évoluer comme système immunitaire : elle patrouille dans la cellule et coupe l’ADN envahisseur (en général viral) partout où apparaît une courte séquence précise, tandis que l’ADN propre de la bactérie est protégé par des marques chimiques. Les enzymes de restriction de type II, utilisées en biologie moléculaire, reconnaissent une séquence de 4 à 8 bases et coupent à une position définie, au sein ou à côté de celle-ci : ce sont des ciseaux programmables — vous choisissez le site, et vous savez exactement où tombe la coupure.

Le seul nombre à retenir : un site de reconnaissance de 6 bases comme le GAATTC de l’EcoRI apparaît par hasard environ une fois tous les 46 = 4096 pb d’ADN aléatoire. C’est pourquoi la digestion d’un génome produit des milliers de fragments, alors que celle d’un petit plasmide en produit en général une poignée : plus l’ADN est court, moins il porte de sites.
Sites de reconnaissance, bouts cohésifs et bouts francs

La plupart des sites de type II sont palindromiques : la séquence se lit de la même façon sur les deux brins (l’EcoRI lit GAATTC que vous lisiez le brin supérieur ou le brin inférieur). L’EcoRI coupe entre le G et le A, en laissant des extrémités simple brin AATT — des bouts « cohésifs » qui s’apparient avec n’importe quel autre bout AATT. Des enzymes comme la SmaI (CCC^GGG) ou l’EcoRV coupent droit à travers les deux brins et laissent des bouts francs, qui peuvent être joints à n’importe quel autre bout franc, mais se ligaturent beaucoup moins efficacement. La BamHI et la BglII reconnaissent des séquences différentes mais laissent le même bout GATC, si bien que leurs fragments peuvent être ligaturés ensemble, même si le site hybride ne correspond plus à aucune des deux enzymes. La BamHI et la BglII coupent des sites différents mais laissent le même bout 5′-GATC : leurs fragments se ligaturent, et c’est là l’astuce du clonage modulaire.

Digestion simple, digestion double, carte des fragments

Une digestion simple répond à la question « où cette enzyme coupe-t-elle ma séquence ? » ; les fragments qu’elle liste sont ce que vous verriez sous forme de bandes après une électrophorèse sur gel. Une digestion double coupe avec deux enzymes à la fois — la méthode standard pour cartographier un plasmide, car l’ensemble combiné des fragments fixe la position relative des sites de chaque enzyme. Notez que cet analyseur traite l’entrée comme une séquence linéaire : une molécule linéaire portant N sites de coupure donne N+1 fragments, tandis qu’un plasmide circulaire avec N sites donne exactement N fragments.

Sites de reconnaissance dégénérés

Certaines enzymes reconnaissent des positions qui tolèrent plus d’une base, écrites avec les lettres de l’IUPAC : la BstEII reconnaît GGTNACC (N = n’importe quelle base), la StyI reconnaît CCWWGG (W = A ou T). Le panneau de recherche de sites accepte le même alphabet, si bien que vous pouvez explorer vous-même n’importe quelle séquence à la recherche de tels motifs dégénérés — par exemple GANTC, le site de la HinfI.

Idées reçues courantes
  • « Un même site de reconnaissance signifie la même enzyme. » SmaI et XmaI lisent toutes deux CCCGGG mais le coupent différemment (franc contre cohésif) ; la séquence de reconnaissance seule ne vous dit jamais où a lieu la coupure.
  • « Les valeurs de tampon et d’inactivation thermique de la base de données sont des lois. » Ce sont des valeurs typiques des fournisseurs ; les tampons diffèrent d’un fournisseur à l’autre, et certaines enzymes demandent des conditions particulières. Vérifiez toujours la fiche technique actuelle avant de préparer une réaction.
  • « Pas de site de coupure, donc l’enzyme est défectueuse. » Le plus souvent, le site est bien là mais bloqué : la méthylation dam/dcm bactérienne recouvre les motifs GATC et CCWGG et empêche plusieurs enzymes d’agir (la BclI en est une victime classique).

Outils associés : Analyse de séquences (teneur en GC et masse moléculaire de l’ADN que vous coupez), Concepteur d’amorces (pour amplifier le fragment voulu), et Calculateurs bio (quelle quantité de digestion charger).