Apa itu mol — dan mengapa semua panel di halaman ini bergantung padanya?
Biologi molekuler terus menanyakan satu pertanyaan dengan kostum berbeda: berapa banyak molekul yang sebenarnya dimiliki? Timbangan membaca gram, spektrofotometer membaca absorbansi, pipet mengukur mikroliter — tetapi reaksi menghitung mol, satuan kimiawan sebesar 6,022×10²³ molekul per mol. Berat molekul (dalam dalton, secara numerik sama dengan g/mol) adalah nilai tukar antara apa yang dapat ditimbang dan apa yang dapat dihitung. Setiap panel di atas — MW, Massa↔Mol, OD260, Pengenceran, Jumlah Salinan, Koefisien Ekstingsi — adalah satu langkah pada pertukaran itu.
Satu angka yang perlu diingat: 1 µg DNA utas ganda 1000 bp berisi sekitar 9,1×10¹¹ molekul. Ini bukan salah ketik — jumlah yang dipipet sangat besar dalam skala molekuler, itulah sebabnya konversi antara massa, konsentrasi, dan jumlah salinan begitu penting.
Massa, mol, dan molaritas
Panel Massa↔Mol membagi gram dengan g/mol untuk mendapatkan mol, dan membagi mol dengan liter untuk mendapatkan molaritas. Contoh: 1 mg protein 50 kDa adalah 1×10−3 g ÷ 50.000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; dilarutkan dalam 1 mL, itu larutan 20 µM. DNA genom sering dibahas dalam mikrogram, oligo dan preparasi plasmid dalam pmol, dan panel Konversi Satuan berpindah di antara semua awalan ini.
OD260: konsentrasi tanpa menimbang
Asam nukleat menyerap UV pada 260 nm mengikuti hukum Beer–Lambert (absorbansi = ekstingsi × konsentrasi × panjang lintasan), sehingga spektrofotometer dapat menggantikan timbangan. Untuk lintasan 1 cm, satu unit absorbansi sesuai dengan sekitar 50 µg/mL DNA utas ganda, 40 µg/mL RNA, atau 33 µg/mL DNA utas tunggal. Pembacaan A280 yang opsional memberikan heuristik kemurnian: DNA bersih berada di sekitar rasio A260/A280 1,8 dan RNA bersih di sekitar 2,0; rasio rendah biasanya berarti protein atau fenol ikut terbawa. Rasio jauh di atas 1,8 pada preparasi DNA menunjukkan arah sebaliknya: RNA ikut terbawa.
Pengenceran: C₁V₁ = C₂V₂
Rumus pengenceran hanyalah kekekalan zat terlarut: mol yang diambil dari stok sama dengan mol yang dikirim. Untuk berpindah dari stok 100 mg/mL ke 10 mg/mL dalam volume akhir 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL stok ditambah 90 mL pelarut, pengenceran 10 kali. Panel Persiapan Buffer menjalankan aritmetika yang sama dengan faktor stok “50×” atau “10×” — membuat 1 L TAE 1× dari stok 50× membutuhkan 1000/50 = 20 mL stok.
Jumlah salinan dan koefisien ekstingsi
Karena setiap salinan plasmid memiliki berat molekul yang sama (sekitar 660 Da per pasangan basa untuk dsDNA), massa dikonversi menjadi jumlah molekul melalui bilangan Avogadro: 1 µg plasmid 5000 bp kira-kira 1,8×10¹¹ salinan, dan 1 pmol apa pun sama dengan 6,02×10¹¹ salinan. Untuk protein, metode Edelhoch memperkirakan absorbansi pada 280 nm hanya dari tiga jenis residu: setiap triptofan menyumbang 5690 M⁻¹cm⁻¹, setiap tirosin 1280, setiap sistin (ikatan disulfida) 120. Protein tanpa residu aromatik nyaris tidak terlihat oleh UV — timbang saja.
Kesalahpahaman umum
- “OD 1 adalah konstanta yang pasti.” Faktor 50/40/33 µg/mL adalah rata-rata empiris untuk polimer panjang; komposisi basa, garam, dan terutama oligonukleotida pendek menggeser nilainya.
- “660 Da per pasangan basa adalah hukum alam.” Itu rata-rata yang praktis — DNA kaya AT dan GC sedikit berbeda, dan kondisi garam berpengaruh. Jangan percaya lebih dari dua angka penting.
- “A260/A280 sebesar 1,6 merusak sampel.” Rasio ini adalah heuristik penyaringan, peka terhadap pH dan buffer; perlakukan sebagai penanda, bukan vonis.
- “Salinan dan pmol dapat dipertukarkan.” Keduanya berbeda faktor 6,02×10¹¹; mencampurkannya adalah kesalahan persiapan qPCR yang klasik.
Alat terkait: Kalkulator Massa Molar (kembaran kimia dari panel MW), Larutan & Pengenceran, Analisis Urutan, dan Kalkulator Genetika.
