Čo je mól — a prečo ním fungujú všetky panely na tejto stránke?
Molekulárna biológia stále kladie jednu otázku v rôznych podobách: koľko molekúl naozaj mám? Váha číta gramy, spektrofotometer absorbanciu, pipeta mikrolitre — ale reakcie počítajú moly, chemickú jednotku 6,022×10²³ molekúl na mól. Molekulová hmotnosť (v daltonoch, číselne rovnaká ako g/mol) je výmenný kurz medzi tým, čo sa dá odvážiť, a tým, čo sa dá spočítať. Každý panel vyššie — MW, hmotnosť↔moly, OD260, riedenie, počet kópií, extinkčný koeficient — je jeden krok v tejto výmene.
Jediné číslo na zapamätanie: 1 µg dvojvláknovej DNA s 1000 bp obsahuje asi 9,1×10¹¹ molekúl. Nie je to preklep — množstvá, ktoré sa pipetujú, sú v molekulárnej mierke astronomicky veľké, preto je prevod medzi hmotnosťou, koncentráciou a počtom kópií taký dôležitý.
Hmotnosť, moly a molarita
Panel hmotnosť↔moly delí gramy g/mol, aby získal moly, a moly delí litrami, aby získal molaritu. Príklad: 1 mg proteínu s 50 kDa je 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; rozpustené v 1 mL je to 20 µM roztok. Genómová DNA sa často udáva v mikrogramoch, oligá a prípravky plazmidov v pmol a panel Prevod jednotiek prechádza medzi všetkými týmito predponami.
OD260: koncentrácia bez váženia
Nukleové kyseliny pohlcujú UV pri 260 nm podľa Beerovho–Lambertovho zákona (absorbancia = extinkcia × koncentrácia × dráha svetla), takže spektrofotometer môže nahradiť váhu. Pri dráhe 1 cm zodpovedá jedna jednotka absorbancie zhruba 50 µg/mL dvojvláknovej DNA, 40 µg/mL RNA alebo 33 µg/mL jednovláknovej DNA. Voliteľné odčítanie A280 dáva heuristiku čistoty: čistá DNA sa drží okolo pomeru A260/A280 1,8 a čistá RNA okolo 2,0; nízky pomer zvyčajne znamená, že sa k nemu prilepil proteín alebo fenol. Pomer výrazne nad 1,8 v prípravku DNA ukazuje opačným smerom: prilepenú RNA.
Riedenie: C₁V₁ = C₂V₂
Vzorec riedenia je len zachovanie rozpustenej látky: mól, ktorý sa odoberie zo zásobného roztoku, sa rovná mólu, ktorý sa dodá. Na prechod zo zásoby 100 mg/mL na 10 mg/mL v konečnom objeme 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL zásoby plus 90 mL rozpúšťadla, desaťnásobné riedenie. Panel Príprava pufra robí tú istú aritmetiku s faktormi zásoby „50ד alebo „10ד — príprava 1 L 1× TAE zo zásoby 50× zaberie 1000/50 = 20 mL zásoby.
Počet kópií a extinkčné koeficienty
Keďže každá kópia plazmidu má rovnakú molekulovú hmotnosť (zhruba 660 Da na pár bázy pre dvojvláknovú DNA), prevod hmotnosti na počet molekúl ide cez Avogadrovo číslo: 1 µg plazmidu s 5000 bp je zhruba 1,8×10¹¹ kópií a 1 pmol čohokoľvek je 6,02×10¹¹ kópií. Pre proteíny metóda Edelhocha predpovedá absorbanciu pri 280 nm len z troch typov zvyškov: každý tryptofán prispieva 5690 M⁻¹cm⁻¹, každý tyrozín 1280, každý cystín (disulfid) 120. Proteín bez aromatických zvyškov je pre UV takmer neviditeľný — namiesto toho ho odvážte.
Časté nedorozumenia
- „OD 1 je presná konštanta.“ Faktory 50/40/33 µg/mL sú empirické priemery pre dlhé polyméry; zloženie báz, soľ a najmä krátke oligonukleotidy ich posúvajú.
- „660 Da na pár báz je prírodný zákon.“ Je to pohodlný priemer — DNA bohatá na AT a GC sa mierne líši a záleží aj na podmienkach soli. Viac než dve platné číslice sa nedajú brať vážne.
- „A260/A280 1,6 mi pokazí vzorku.“ Pomer je heuristika na triedenie, citlivá na pH a pufer; berte ho ako upozornenie, nie ako verdikt.
- „Kópie a pmol sú zameniteľné.“ Líšia sa faktorom 6,02×10¹¹; zámena je klasická chyba pri príprave qPCR.
Súvisiace nástroje: Kalkulačka molárnej hmotnosti (chemický náprotivok panelu MW), Roztoky a riedenie, Analýza sekvencií a Genetická kalkulačka.
