Analýza sekvencií DNA a proteínov

Analýza sekvencií DNA, RNA a proteínov s reverzným komplementom, transkripciou, translácie v 6 rámcoch, obsahom GC, teplotou topenia, molekulovou hmotnosťou a frekvenciou využitia kodónov. Ďalšie: Návrh primerov | Reštrikčné enzýmy.

Zadá sa sekvencia DNA, aby sa získal jej reverzný komplement (5'→3'). Podporuje kódy nejednoznačnosti IUPAC.

Formát sekvencie: používajú sa štandardné nukleotidové kódy IUPAC: A, C, G, T (DNA) alebo U (RNA). Kódy nejednoznačnosti: R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, S=CG, W=AT, H=ACT, B=CGT, V=ACG, D=AGT, N=ľubovoľná. Sekvencie nerozlišujú veľkosť písmen; medzery a čísla sa ignorujú.
Čo vlastne analýza sekvencie DNA počíta?

DNA je reťazec zo štyroch písmen s dvoma nepríjemnými vlastnosťami: obe vlákna bežia opačnými smermi a správa sa dá čítať len v blokoch po troch. Takmer každý panel na tejto stránke rieši jednu z týchto dvoch skutočností — orientáciu vlákna (reverzný komplement, transkripcia) alebo trojicový kód (translácia, čítacie rámce). Ostatné panely merajú fyzikálne vlastnosti (obsah GC, teplotu topenia, molekulovú hmotnosť), ktoré vyplývajú z samotných písmen.

Jediné číslo na zapamätanie: genetický kód má 64 kodónov (4×4×4), ale len 20 aminokyselín plus stop kodóny — kód je degenerovaný, takže viacero rôznych kodónov (napr. CTT, CTC, CTA, CTG všetky čítané ako leucín) zapisuje ten istý zvyšok. Práve táto redundancia je dôvod, prečo môže tichá mutácia zmeniť sekvenciu bez zmeny bielkoviny.
Reverzný komplement: čítanie druhého vlákna

Vlákna DNA sú antiparalelné a A sa páruje s T, C s G. Ak je sekvencia na hornom vlákne, všetko, čo funguje na dolnom vlákne (gén, miesto nasadania primeru, reštrikčné miesto), sa zobrazí ako reverzný komplement: reťazec sa otočí od konca ku koncu a každá báza sa vymení za svojho partnera. Príklad: sekvencia 5'→3' ATGCGT má reverzný komplement ACGCAT — a dvojaké použitie tejto operácie vždy vráti pôvodnú sekvenciu.

Transkripcia a translácia

Transkripcia skopíruje gén do RNA, pričom tymín nahradí uracilom. Translácia potom číta RNA (alebo kódujúce vlákno DNA) v kodónoch po troch bázach: ATG začína bielkovinu (metionín), TAA/TAG/TGA ju ukončujú. Pretože čítací rámec môže začínať na pozícii 1, 2 alebo 3 na ktoromkoľvek vlákne, každá dvojvláknová DNA ponúka šesť možných rámcov — a zvyčajne len jeden kóduje skutočný dlhý ORF (otvorený čítací rámec). Panel translácie zobrazí všetkých šesť, takže pravý gén sa prejaví ako rámec s čistým úsekom od štartu po stop. Pretože polymeráza číta templátové vlákno, mRNA sa zhoduje s kódujúcim vláknom s U namiesto T.

Obsah GC, Tm a molekulová hmotnosť

Páry GC zdieľajú tri vodíkové väzby oproti dvom pri AT, takže DNA bohatá na GC je stabilnejšia: topí sa pri vyššej teplote (vyššia Tm), drží pevnejšie zložené štruktúry a v celých genómoch je jej podiel znakom druhu, ktorý sa pohybuje od približne 25 % do 75 % u baktérií. Molekulová hmotnosť sčíta hmotnosti jednotlivých nukleotidov (približne 330 Da priemerne pre jednovláknovú DNA, dvojnásobok pre duplex s komplementárnym vláknom). Panel Využitie kodónov počíta, ktoré zo synonymných kodónov gén uprednostňuje — silne skreslené využitie môže odhaliť vysoko exprimované gény.

Časté nedorozumenia
  • „Reverzný komplement je len komplement.“ Samotné doplnenie dá reťazec 3'→5'; až jeho následné obrátenie obnoví bežnú orientáciu 5'→3', ktorú používajú polymerázy a učebnice.
  • „Stop kodón znamená koniec génu.“ V náhodnom čítacom rámci sa stop kodóny objavujú náhodne približne každých 21 kodónov; skutočný ORF sa posudzuje podľa dĺžky a správneho začiatku, nie podľa jedného stop kodónu.
  • „Obsah GC je len percento.“ Predpovedá aj správanie pri nasadaní: návrh PCR primerov, sond a prísnosť hybridizácie sa na ňom všetky zakladajú (súvisiace: Návrh primerov).

Súvisiace nástroje: Návrh primerov (Tm, diméry, kontrola páru), Reštrikčné enzýmy (kde padnú rezy v tej istej sekvencii) a Bio kalkulačky (hmotnosť, molarita a počet kópií z týchto výsledkov MW).