Čo je reštrikčný enzým?
Reštrikčný enzým je pár molekulárnych nožníc, ktoré baktérie vyvinuli ako imunitný systém: prehľadáva bunku a štiepi cudziu DNA (zvyčajne z vírusu) všade tam, kde sa objaví jedna špecifická krátka sekvencia, zatiaľ čo vlastná DNA baktérie je chránená chemickými značkami. Reštrikčné enzýmy typu II, ktoré sa používajú v molekulárnej biológii, rozpoznávajú sekvenciu s 4–8 bázami a štiepia na definovanej pozícii v nej alebo vedľa nej — programovateľné nožnice: zvolíte miesto a presne sa vie, kam rez dopadne.
Jediné číslo na zapamätanie: šesťbázové rozpoznávacie miesto, ako je GAATTC enzýmu EcoRI, sa náhodou objaví približne raz na každých 46 = 4096 bp náhodnej DNA. Preto štiepenie genómu vytvorí tisíce fragmentov, ale štiepenie malého plazmidu zvyčajne len hŕstku — čím kratšia DNA, tým menej miest obsahuje.
Rozpoznávacie miesta, lepivé konce a tupé konce
Väčšina miest typu II je palindrómová: sekvencia sa číta rovnako na oboch vláknach (EcoRI číta GAATTC, či sa beží po hornom alebo dolnom vlákne). EcoRI štiepi medzi G a A a zanecháva jednovláknové presahy AATT — „lepivé“ konce, ktoré sa spárujú s každým iným presahom AATT. Enzýmy ako SmaI (CCC^GGG) a EcoRV štiepia priamo cez obe vlákna a zanechávajú tupé konce, ktoré sa dajú spojiť s akýmkoľvek iným tupým koncom, ale ligujú oveľa menej účinne. BamHI a BglII rozpoznávajú rozdielne sekvencie, no obe zanechávajú rovnaký presah GATC, takže ich fragmenty sa dajú spojiť, hoci hybridné miesto potom nezodpovedá ani jednému enzýmu. BamHI a BglII štiepia rozdielne miesta, ale zanechávajú rovnaký presah 5′-GATC, takže ich fragmenty sa ligujú — trik za modulárnym klonovaním.
Jednoduché štiepenie, dvojité štiepenie, mapa fragmentov
Jednoduché štiepenie odpovedá na otázku „kde tento enzým štiepi danú sekvenciu?“; fragmenty, ktoré vypíše, sú to, čo by sa videlo ako pásy po gélovej elektroforéze. Dvojité štiepenie štiepi dvoma enzýmami naraz — štandardný spôsob mapovania plazmidu, pretože kombinovaná množina fragmentov určí, kde sa miesta každého enzýmu nachádzajú vzhľadom na seba. Tento analyzátor berie vstup ako lineárnu sekvenciu: lineárna molekula s N miestami rezu dá N+1 fragmentov, zatiaľ čo kruhový plazmid s N miestami dá presne N fragmentov.
Degenerované rozpoznávacie miesta
Niektoré enzýmy čítajú pozície, ktoré tolerujú viac než jednu bázu, zapisované písmenami IUPAC: BstEII rozpoznáva GGTNACC (N = ľubovoľná báza), StyI rozpoznáva CCWWGG (W = A alebo T). Panel Vyhľadávanie miest prijíma tú istú abecedu, takže ľubovoľnú sekvenciu možno prehľadať na takéto degenerované vzory samostatne — napríklad GANTC, miesto enzýmu HinfI.
Časté nedorozumenia
- „Rovnaké rozpoznávacie miesto znamená ten istý enzým.“ SmaI aj XmaI čítajú
CCCGGG, ale štiepia ho inak (tupo verzus lepivo); samotná rozpoznávacia sekvencia nikdy nehovorí, kde je miesto rezu.
- „Pufer a hodnoty inaktivácie teplom v databáze sú zákony.“ Sú to typické hodnoty výrobcov; pufre sa medzi dodávateľmi líšia a niektoré enzýmy potrebujú osobitné podmienky — pred prípravou reakcie sa vždy overí aktuálny technický list.
- „Žiadne miesta rezu znamenajú, že enzým je pokazený.“ Častejšie je miesto prítomné, ale zablokované — bakteriálna metylácia dam/dcm prekrýva motívy GATC a CCWGG a zastaví niekoľko enzýmov (BclI je klasická obeť).
Súvisiace nástroje: Analýza sekvencií (obsah GC a MW DNA, štiepenej), Návrh primerov (amplifikácia fragmentu, ktorý sa má získať) a Bio kalkulačky (koľko štiepenia nanášať).
