Enzyme giới hạn là gì?
Enzyme giới hạn là một cặp kéo phân tử mà vi khuẩn đã tiến hóa để làm hệ miễn dịch: nó tuần tra tế bào và cắt DNA xâm nhập (thường từ virus) ở bất cứ đâu xuất hiện một trình tự ngắn xác định, trong khi DNA của chính vi khuẩn được bảo vệ bởi các dấu hóa học. Các enzyme giới hạn Type II dùng trong sinh học phân tử nhận biết một trình tự 4–8 base và cắt tại một vị trí xác định bên trong hoặc cạnh nó — một cặp kéo có thể lập trình: chọn vị trí, và bạn biết chính xác chỗ cắt sẽ nằm đâu.
Con số duy nhất cần nhớ: một vị trí nhận biết 6 base như GAATTC của EcoRI xuất hiện ngẫu nhiên khoảng cứ 46 = 4096 bp DNA ngẫu nhiên một lần. Đó là lý do vì sao cắt một bộ gen tạo ra hàng nghìn đoạn, còn cắt một plasmid nhỏ thường chỉ tạo ra vài đoạn — DNA càng ngắn thì mang càng ít vị trí.
Vị trí nhận biết, đầu dính và đầu bằng
Hầu hết các vị trí Type II là palindrome: trình tự đọc giống nhau trên cả hai mạch (EcoRI đọc GAATTC dù bạn đọc theo mạch trên hay mạch dưới). EcoRI cắt giữa G và A, để lại đoạn nhô AATT sợi đơn — các đầu “dính” có thể bắt cặp với bất kỳ đoạn nhô AATT nào khác. Các enzyme như SmaI (CCC^GGG) và EcoRV cắt thẳng ngang qua cả hai mạch và để lại đầu bằng, có thể nối với bất kỳ đầu bằng nào khác nhưng nối kém hiệu quả hơn nhiều. BamHI và BglII nhận biết các trình tự khác nhau nhưng cùng để lại một đoạn nhô GATC, nên các đoạn của chúng có thể nối với nhau, dù vị trí lai sau đó không khớp với enzyme nào. BamHI và BglII cắt các vị trí khác nhau nhưng cùng để lại đoạn nhô 5′-GATC, nên các đoạn của chúng nối được — đó là mẹo đứng sau clone mô-đun.
Cắt đơn, cắt kép, bản đồ đoạn
Phép cắt đơn trả lời câu hỏi “enzyme này cắt trình tự của tôi ở đâu?”; các đoạn nó liệt kê là những gì bạn thấy thành vạch sau điện di gel. Phép cắt kép cắt bằng hai enzyme cùng lúc — cách chuẩn để lập bản đồ một plasmid, vì tập hợp đoạn kết hợp xác định vị trí các vị trí của mỗi enzyme so với nhau. Lưu ý rằng bộ phân tích này coi đầu vào là một trình tự thẳng: một phân tử thẳng có N vị trí cắt cho N+1 đoạn, còn một plasmid vòng có N vị trí cho đúng N đoạn.
Vị trí nhận biết suy biến
Một số enzyme đọc các vị trí chấp nhận nhiều hơn một base, được viết bằng ký hiệu IUPAC: BstEII nhận biết GGTNACC (N = bất kỳ base nào), StyI nhận biết CCWWGG (W = A hoặc T). Khung Tìm vị trí cũng chấp nhận cùng bảng ký hiệu, nên bạn có thể tự quét mọi trình tự để tìm các mẫu suy biến như vậy — ví dụ GANTC, vị trí của HinfI.
Những hiểu lầm thường gặp
- “Cùng vị trí nhận biết thì là cùng enzyme.” SmaI và XmaI đều đọc
CCCGGG nhưng cắt theo cách khác nhau (đầu bằng so với đầu dính); riêng trình tự nhận biết không cho bạn biết vị trí cắt. - “Các giá trị đệm và bất hoạt bằng nhiệt trong cơ sở dữ liệu là quy luật.” Chúng là giá trị điển hình của nhà cung cấp; đệm khác nhau giữa các nhà cung cấp và một số enzyme cần điều kiện đặc biệt — luôn kiểm tra bảng dữ liệu hiện hành trước khi thiết lập phản ứng.
- “Không có vị trí cắt nghĩa là enzyme bị hỏng.” Thường hơn, vị trí có đó nhưng bị chặn — sự metyl hóa dam/dcm của vi khuẩn phủ lên các motif GATC và CCWGG và ngăn một số enzyme (BclI là nạn nhân kinh điển).
Công cụ liên quan: Phân tích trình tự (hàm lượng GC và MW của DNA bạn đang cắt), Thiết kế primer (khuếch đại đoạn bạn muốn), và Máy tính sinh học (cần nạp bao nhiêu sản phẩm cắt).
