Co je mol — a proč pohání každý panel na této stránce?
Molekulární biologie se pořád ptá na jednu otázku v různých kostýmech: kolik molekul vlastně mám? Váha ukazuje gramy, spektrofotometr absorbanci, pipeta mikrolitry — ale reakce počítají moly, chemickou jednotku 6,022×10²³ molekul na mol. Molekulová hmotnost (v daltonech, číselně shodná s g/mol) je směnný kurz mezi tím, co lze zvážit, a tím, co lze spočítat. Každý panel výše — MW, hmotnost↔moly, OD260, ředění, počet kopií, extinkční koeficient — je jeden krok na této směnárně.
Jediné číslo, které si zapamatujte: 1 µg dvouvláknové DNA o 1000 bp obsahuje asi 9,1×10¹¹ molekul. Není to překlep — množství, která pipetujete, jsou na molekulární úrovni astronomicky velká, a proto je tak důležité převádět mezi hmotností, koncentrací a počtem kopií.
Hmotnost, moly a molarita
Panel hmotnost↔moly dělí gramy g/mol, čímž získá moly, a moly dělí litry, čímž získá molaritu. Příklad: 1 mg proteinu o 50 kDa je 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; rozpuštěno v 1 mL je to roztok 20 µM. Genomová DNA se často uvádí v mikrogramech, oligy a plazmidové přípravky v pmol a panel převod jednotek přepíná mezi všemi těmito předponami.
OD260: koncentrace bez vážení
Nukleové kyseliny absorbují UV záření při 260 nm podle Beer–Lambertova zákona (absorbance = extinkce × koncentrace × délka dráhy), takže spektrofotometr může nahradit váhu. Pro dráhu 1 cm odpovídá jedna jednotka absorbance zhruba 50 µg/mL dvouvláknové DNA, 40 µg/mL RNA nebo 33 µg/mL jednovláknové DNA. Volitelné měření A280 dává heuristiku čistoty: čistá DNA leží poblíž poměru A260/A280 1,8 a čistá RNA poblíž 2,0; nízký poměr obvykle znamená, že s ní jde protein nebo fenol. Poměr výrazně nad 1,8 v přípravku DNA naopak ukazuje na RNA, která se k němu přimíchala.
Ředění: C₁V₁ = C₂V₂
Vzorec pro ředění je jen zachování rozpuštěné látky: moly odebrané ze zásobního roztoku se rovnají molům dodaným. Přechod ze zásobního roztoku 100 mg/mL na 10 mg/mL v konečném objemu 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL zásoby plus 90 mL rozpouštědla, desetinásobné ředění. Panel příprava pufru počítá totéž s faktory zásoby „50ד nebo „10ד — příprava 1 L 1× TAE z 50× zásoby vyžaduje 1000/50 = 20 mL zásoby.
Počet kopií a extinkční koeficienty
Protože každá kopie plazmidu má stejnou molekulovou hmotnost (zhruba 660 Da na pár bází u dvouvláknové DNA), převádí se hmotnost na počet molekul přes Avogadrovo číslo: 1 µg plazmidu o 5000 bp je zhruba 1,8×10¹¹ kopií a 1 pmol čehokoli je 6,02×10¹¹ kopií. U proteinů Edelhochova metoda předpovídá absorbanci při 280 nm jen ze tří typů zbytků: každý tryptofan přispívá 5690 M⁻¹cm⁻¹, každý tyrosin 1280, každý cystin (disulfid) 120. Protein bez aromatických zbytků je pro UV téměř neviditelný — zvažte ho raději.
Časté nedorozumění
- “OD 1 je přesná konstanta.” Faktory 50/40/33 µg/mL jsou empirické průměry pro dlouhé polymery; složení bází, sůl a zejména krátké oligonukleotidy je posouvají.
- “660 Da na pár bází je přírodní zákon.” Je to pohodlný průměr — DNA bohatá na AT a GC se mírně liší a záleží i na podmínkách soli. Nevěřte víc než dvěma platným číslicím.
- “Poměr A260/A280 1,6 mi zkazí vzorek.” Poměr je screeningová heuristika citlivá na pH a pufr; berte ji jako upozornění, ne jako verdikt.
- “Kopie a pmol jsou zaměnitelné.” Liší se faktorem 6,02×10¹¹; zaměnit je je klasická chyba při přípravě qPCR.
Související nástroje: Kalkulačka molární hmotnosti (chemický protějšek panelu MW), Roztoky & ředění, Analýza sekvencí a Genetický kalkulátor.
