Co vlastně analýza sekvence DNA počítá?
DNA je řetězec čtyř písmen se dvěma nepohodlnými vlastnostmi: dvě vlákna běží opačnými směry a sdělení se dá číst jen po trojicích. Téměř každý panel na této stránce řeší jednu z těchto dvou skutečností — orientaci vláken (reverzní komplement, transkripce) nebo trojicový kód (translace, čtecí rámce). Zbývající panely měří fyzikální vlastnosti (obsah GC, teplotu tání, molekulovou hmotnost), které vyplývají z písmen samotných.
Jediné číslo, které si zapamatujte: genetický kód má 64 kodonů (4×4×4), ale jen 20 aminokyselin plus stop kodony — kód je degenerovaný, takže několik různých kodonů (např. CTT, CTC, CTA, CTG všechny čtou leucin) zapisuje tentýž zbytek. Tato redundance je důvod, proč může tichá mutace změnit sekvenci, aniž by se změnil protein.
Reverzní komplement: čtení druhého vlákna
Dvě vlákna DNA jsou antiparalelní a A páruje s T, C s G. Pokud je vaše sekvence na horním vlákně, vše, co funguje na dolním vlákně (gen, vazebné místo primeru, restrikční místo), se objeví jako reverzní komplement: otočte řetězec od konce ke konci a vyměňte každou bázi za její partnerskou. Příklad: sekvence 5′→3′ ATGCGT má reverzní komplement ACGCAT — a dvojí použití operace vždy vrátí původní sekvenci.
Transkripce a translace
Transkripce přepisuje gen do RNA a zaměňuje thymin za uracil. Translace pak čte RNA (nebo kódující vlákno DNA) po kodonech o třech bázích: ATG zahajuje protein (methionin), TAA/TAG/TGA jej ukončují. Protože čtecí rámec může začít na pozici 1, 2 nebo 3 na kterémkoli vláknu, nabízí každá dvouvláknová DNA šest možných rámců — a obvykle jen jeden kóduje skutečný dlouhý ORF (otevřený čtecí rámec). Panel translace ukazuje všech šest, takže pravý gen se prozradí jako rámec s čistým úsekem od startu ke stopu. Protože polymeráza čte templátové vlákno, mRNA odpovídá kódujícímu vláknu s U místo T.
Obsah GC, Tm a molekulová hmotnost
Páry GC sdílejí tři vodíkové vazby proti dvěma u AT, takže DNA bohatá na GC je stabilnější: taje při vyšší teplotě (vyšší Tm), drží těsnější skladby a v celých genomech je jejich podíl druhovým znakem, který se u bakterií pohybuje zhruba od 25 % do 75 %. Molekulová hmotnost sčítá hmotnosti jednotlivých nukleotidů (průměrně asi 330 Da pro jednovláknovou DNA, dvojnásobek pro duplex s komplementárním vláknem). Panel využití kodonů počítá, který ze synonymních kodonů gen preferuje — silně zkreslené použití může odhalit vysoce exprimované geny.
Časté nedorozumění
- “Reverzní komplement je jen komplement.” Samotné doplnění dá řetězec 3′→5′; teprve jeho následné obrácení obnoví konvenční orientaci 5′→3′, kterou používají polymerázy i učebnice.
- “Stop kodon znamená konec genu.” V náhodném čtecím rámci se stop kodony objevují náhodně zhruba každých 21 kodonů; skutečný ORF se posuzuje podle délky a správného startu, ne podle jediného stop kodonu.
- “Obsah GC je jen procento.” Předpovídá také chování při nasedání: návrh primerů PCR, návrh sond a přísnost hybridizace se na něj opírají (viz Návrh primerů).
Související nástroje: Návrh primerů (Tm, dimery, kontrola páru), Restrikční enzymy (kde v téže sekvenci dopadají řezy) a Bio kalkulačky (hmotnost, molarita a počet kopií z těchto výsledků MW).
