Analyzátor restrikčních enzymů

Analyzujte sekvence DNA restrikčními enzymy — provádějte jednoduché a dvojité štěpení, analyzujte restrikční fragmenty, procházejte databázi více než 60 restrikčních enzymů typu II a hledejte restrikční místa pomocí kódů IUPAC. Dále: Analýza sekvencí | Návrh primerů.

Zadejte sekvenci DNA a vyberte restrikční enzym, abyste našli všechna řezná místa a výsledné délky fragmentů.

Kódy nejednoznačnosti IUPAC: R=A|G, Y=C|T, M=A|C, K=G|T, S=C|G, W=A|T, H=A|C|T, B=C|G|T, V=A|C|G, D=A|G|T, N=libovolná. Data o enzymech sestavena z publikované literatury a veřejných databází.
Co je restrikční enzym?

Restrikční enzym je pár molekulárních nůžek, které se bakterie vyvinuly jako imunitní systém: prohledává buňku a řeže cizí DNA (obvykle virovou) všude, kde se objeví jedna konkrétní krátká sekvence, zatímco vlastní DNA bakterie chrání chemické značky. Enzymy typu II, používané v molekulární biologii, rozpoznávají sekvenci o 4–8 bázích a řežou na definované pozici uvnitř ní nebo vedle ní — programovatelné nůžky: zvolíte místo a přesně víte, kam řez dopadne.

Jediné číslo, které si zapamatujte: šestibázové rozpoznávací místo, jako je GAATTC u EcoRI, se v náhodné DNA objeví zhruba jednou za 46 = 4096 bp. Proto štěpení genomu vytvoří tisíce fragmentů, zatímco štěpení malého plazmidu obvykle vytvoří hrstku — čím kratší DNA, tím méně míst obsahuje.
Rozpoznávací místa, lepivé a tupé konce

Většina míst typu II je palindromických: sekvence se čte stejně na obou vláknech (EcoRI čte GAATTC ať jdete po horním, nebo dolním vláknu). EcoRI řeže mezi G a A a zanechá jednovláknové přesahy AATT — „lepivé“ konce, které se spojí s jakýmkoli jiným přesahem AATT. Enzymy jako SmaI (CCC^GGG) a EcoRV řežou přímo napříč oběma vlákny a zanechají tupé konce, které lze spojit s jakýmkoli jiným tupým koncem, ale ligují mnohem méně účinně. BamHI a BglII rozpoznávají různé sekvence, a přesto zanechávají stejný přesah GATC, takže jejich fragmenty lze spojit, i když hybridní místo po spojení neodpovídá ani jednomu enzymu. BamHI a BglII řežou různá místa, ale zanechávají stejný přesah 5′-GATC, takže jejich fragmenty ligují — trik za modulárním klonováním.

Jednoduché štěpení, dvojité štěpení, mapa fragmentů

Jednoduché štěpení odpovídá na otázku „kde tento enzym řeže mou sekvenci?“; fragmenty, které vypíše, jsou pásy, které uvidíte po gelové elektroforéze. Dvojité štěpení řeže dvěma enzymy najednou — standardní způsob mapování plazmidu, protože kombinovaná sada fragmentů určí, kde jsou místa každého enzymu vzhledem k sobě. Tento analyzátor bere vstup jako lineární sekvenci: lineární molekula s N řeznými místy dá N+1 fragmentů, zatímco kruhový plazmid s N místy dá přesně N fragmentů.

Degenerovaná rozpoznávací místa

Některé enzymy čtou pozice, které snášejí více než jednu bázi, zapsané písmeny IUPAC: BstEII rozpoznává GGTNACC (N = libovolná báze), StyI rozpoznává CCWWGG (W = A nebo T). Panel hledání míst přijímá stejnou abecedu, takže můžete libovolnou sekvenci prohledat na takové degenerované vzory sami — například GANTC, místo HinfI.

Časté nedorozumění
  • “Stejné rozpoznávací místo znamená týž enzym.” SmaI i XmaI čtou CCCGGG, ale řežou ho jinak (tupě vs. lepivě); samotná rozpoznávací sekvence nikdy neříká pozici řezu.
  • “Hodnoty pufru a tepelné inaktivace z databáze jsou zákony.” Jsou to typické hodnoty výrobců; pufry se mezi dodavateli liší a některé enzymy potřebují zvláštní podmínky — před přípravou reakce vždy zkontrolujte aktuální technický list.
  • “Žádná řezná místa znamenají, že je enzym rozbitý.” Častěji je místo přítomno, ale zablokováno — bakteriální metylace dam/dcm překrývá motivy GATC a CCWGG a zastaví několik enzymů (BclI je klasická oběť).

Související nástroje: Analýza sekvencí (obsah GC a MW DNA, kterou štěpíte), Návrh primerů (amplifikace fragmentu, který chcete) a Bio kalkulačky (kolik štěpení nanést na gel).