Βιοχημικοί υπολογιστές

Βασικοί βιοχημικοί υπολογισμοί — μοριακό βάρος, μετατροπή μάζας σε γραμμομόρια, προσδιορισμός συγκέντρωσης με A260, αραίωση C1V1, αριθμός αντιγράφων, συντελεστής απορρόφησης πρωτεΐνης, συνταγές παρασκευής ρυθμιστικών και μετατροπή μονάδων. Επίσης: Ανάλυση αλληλουχιών | Υπολογιστής γενετικής.

Εισαγωγή αλληλουχίας DNA/RNA, αλληλουχίας πρωτεΐνης (μονοσύμβολος κώδικας) ή χημικού τύπου για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους.

Βιβλιογραφία: Συντελεστές μετατροπής A260: dsDNA=50 µg/mL, ssDNA=33 µg/mL, RNA=40 µg/mL ανά 1,0 OD. Μέσο MW νουκλεοτιδίου: ~330 Da (dsDNA). Απορρόφηση πρωτεΐνης στα 280 nm: Trp=5690, Tyr=1280, Cys(κυστίνη)=120 M⁻¹cm⁻¹. Συνταγές ρυθμιστικών βασισμένες σε τυπικά πρωτόκολλα μοριακής βιολογίας (Sambrook & Russell).
Τι είναι το γραμμομόριο — και γιατί λειτουργεί σε κάθε πάνελ αυτής της σελίδας;

Η μοριακή βιολογία θέτει διαρκώς το ίδιο ερώτημα με διαφορετικά ρούχα: πόσα μόρια έχω πραγματικά; Ένας ζυγός δίνει γραμμάρια, ένα φασματοφωτόμετρο δίνει απορρόφηση, μια πιπέτα μετρά μικρολίτρα — όμως οι αντιδράσεις μετρούν γραμμομόρια, τη μονάδα του χημικού για 6,022×10²³ μόρια ανά γραμμομόριο. Το μοριακό βάρος (σε dalton, αριθμητικά ίσο με g/mol) είναι η ισοτιμία ανάμεσα σε όσα μπορούμε να ζυγίσουμε και σε όσα μπορούμε να μετρήσουμε. Κάθε πάνελ πάνω — MW, Μάζα↔Γραμμομόρια, OD260, Αραίωση, Αριθμός αντιγράφων, Συντελεστής απορρόφησης — είναι ένα βήμα σε αυτή την ισοτιμία.

Ο αριθμός που πρέπει να θυμάται κανείς: 1 µg DNA δίκλωνο 1000 bp περιέχει περίπου 9,1×10¹¹ μόρια. Δεν είναι τυπογραφικό λάθος — οι ποσότητες που μεταφέρονται με πιπέτα είναι αστρονομικά μεγάλες στη μοριακή κλίμακα, γι' αυτό η μετατροπή ανάμεσα σε μάζα, συγκέντρωση και αριθμό αντιγράφων έχει τόση σημασία.
Μάζα, γραμμομόρια και μοριακότητα

Το πάνελ Μάζα↔Γραμμομόρια διαιρεί τα γραμμάρια με τα g/mol για να βρει τα γραμμομόρια, και τα γραμμομόρια με τα λίτρα για να βρει τη μοριακότητα. Παράδειγμα: 1 mg πρωτεΐνης των 50 kDa είναι 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol· διαλυμένο σε 1 mL, αυτό είναι διάλυμα 20 µM. Το γονιδιωματικό DNA συζητείται συχνά σε μικρογραμμάρια, τα ολιγονουκλεοτίδια και τα παρασκευάσματα πλασμιδίων σε pmol, και το πάνελ Μετατροπή μονάδων μεταφέρεται ανάμεσα σε όλα αυτά τα πρόθεμα.

OD260: συγκέντρωση χωρίς ζύγισμα

Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν UV στα 260 nm σύμφωνα με τον νόμο Beer–Lambert (απορρόφηση = συντελεστής × συγκέντρωση × μήκος διαδρομής), οπότε ένα φασματοφωτόμετρο μπορεί να αντικαταστήσει τον ζυγό. Για διαδρομή 1 cm, μία μονάδα απορρόφησης αντιστοιχεί περίπου σε 50 µg/mL δίκλωνου DNA, 40 µg/mL RNA ή 33 µg/mL μονόκλωνου DNA. Η προαιρετική μέτρηση A280 δίνει μια ευρετική καθαρότητας: καθαρό DNA βρίσκεται κοντά στον λόγο A260/A280 1,8 και καθαρό RNA κοντά στο 2,0· ένας χαμηλός λόγος συνήθως σημαίνει ότι συνοδεύονται πρωτεΐνη ή φαινόλη. Ένας λόγος αισθητά πάνω από 1,8 σε παρασκεύασμα DNA δείχνει προς την αντίθετη κατεύθυνση: ότι συνοδεύεται RNA.

Αραίωση: C₁V₁ = C₂V₂

Ο τύπος αραίωσης είναι απλώς διατήρηση της διαλυμένης ουσίας: τα γραμμομόρια που αντλούνται από το απόθεμα ισούνται με εκείνα που παραδίδονται. Για να περάσουμε από απόθεμα 100 mg/mL σε 10 mg/mL σε τελικό όγκο 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL αποθέματος συν 90 mL διαλύτη, αραίωση δεκαπλάσια. Το πάνελ Παρασκευή ρυθμιστικού κάνει την ίδια αριθμητική με παράγοντες αποθέματος “50×” ή “10×” — για να γίνει 1 L TAE 1× από απόθεμα 50× χρειάζονται 1000/50 = 20 mL αποθέματος.

Αριθμός αντιγράφων και συντελεστές απορρόφησης

Επειδή κάθε αντίγραφο πλασμιδίου έχει το ίδιο μοριακό βάρος (περίπου 660 Da ανά ζεύγος βάσεων για δίκλωνο DNA), η μάζα μετατρέπεται σε αριθμό μορίων μέσω του αριθμού Avogadro: 1 µg πλασμιδίου 5000 bp είναι περίπου 1,8×10¹¹ αντίγραφα, και 1 pmol οτιδήποτε είναι 6,02×10¹¹ αντίγραφα. Για πρωτεΐνες, η μέθοδος Edelhoch προβλέπει την απορρόφηση στα 280 nm από μόλις τρεις τύπους καταλοίπων: κάθε τρυπτοφάνη συνεισφέρει 5690 M⁻¹cm⁻¹, κάθε τυροσίνη 1280, κάθε κυστίνη (δισουλφίδιο) 120. Μια πρωτεΐνη χωρίς αρωματικά κατάλοιπα είναι σχεδόν αόρατη στο UV — καλύτερα να ζυγιστεί αντί γι' αυτό.

Συνηθισμένες παρανοήσεις
  • “Το OD 1 αντιστοιχεί σε σταθερή ακριβή τιμή.” Οι συντελεστές 50/40/33 µg/mL είναι εμπειρικοί μέσοι όροι για μακρά πολυμερή· η βασική σύνθεση, το άλας και ιδιαίτερα τα σύντομα ολιγονουκλεοτίδια τους μετατοπίζουν.
  • “Τα 660 Da ανά ζεύγος βάσεων είναι φυσικός νόμος.” Είναι ένας βολικός μέσος όρος — το DNA πλούσιο σε AT και σε GC διαφέρει ελαφρώς, και οι συνθήκες άλατος έχουν σημασία. Δεν πρέπει να εμπιστεύεται κανείς περισσότερα από δύο σημαντικά ψηφία.
  • “Ένα A260/A280 1,6 καταστρέφει ένα δείγμα.” Ο λόγος είναι ευρετική διαλογής, ευαίσθητη στο pH και στο ρυθμιστικό· ο λόγος αντιμετωπίζεται ως ένδειξη και όχι ως ετυμηγορία.
  • “Τα αντίγραφα και τα pmol είναι εναλλάξιμα.” Διαφέρουν κατά παράγοντα 6,02×10¹¹· η σύγχυση μεταξύ τους είναι κλασικό σφάλμα ρύθμισης qPCR.

Σχετικά εργαλεία: Υπολογιστής μοριακής μάζας (το χημικό αντίστοιχο του πάνελ MW), Διαλύματα & αραίωση, Ανάλυση αλληλουχιών και Υπολογιστής γενετικής.