Τι υπολογίζει πραγματικά η ανάλυση αλληλουχίας DNA;
Το DNA είναι μια αλυσίδα τεσσάρων γραμμάτων με δύο άβολες ιδιότητες: οι δύο αλυσίδες τρέχουν σε αντίθετες κατευθύνσεις, και το μήνυμα είναι αναγνώσιμο μόνο σε ομάδες των τριών. Σχεδόν κάθε πάνελ αυτής της σελίδας υπάρχει για να χειριστεί μία από αυτές τις δύο ιδιότητες — τον προσανατολισμό της αλυσίδας (αντίστροφο συμπλήρωμα, μεταγραφή) ή τον τριπλό κώδικα (μετάφραση, πλαίσια ανάγνωσης). Τα υπόλοιπα πάνελ μετρούν φυσικές ιδιότητες (περιεκτικότητα GC, θερμοκρασία τήξης, μοριακό βάρος) που προκύπτουν από τα ίδια τα γράμματα.
Ο αριθμός που πρέπει να θυμάται κανείς: ο γενετικός κώδικας έχει 64 κωδικόνια (4×4×4) αλλά μόνο 20 αμινοξέα συν τα σήματα τερματισμού — ο κώδικας είναι εκφυλισμένος, οπότε αρκετά διαφορετικά κωδικόνια (π.χ. τα CTT, CTC, CTA, CTG διαβάζονται όλα ως λευκίνη) δηλώνουν το ίδιο κατάλοιπο. Αυτή η πλεονάζουσα πληροφορία εξηγεί γιατί μια σιωπηλή μετάλλαξη μπορεί να αλλάξει μια αλληλουχία χωρίς να αλλάξει μια πρωτεΐνη.
Αντίστροφο συμπλήρωμα: ανάγνωση της άλλης αλυσίδας
Οι δύο αλυσίδες του DNA είναι αντιπαράλληλες, και το A ζευγαρώνει με το T, το C με το G. Αν η αλληλουχία βρίσκεται στην πάνω αλυσίδα, ό,τι λειτουργεί στην κάτω αλυσίδα (γονίδιο, θέση πρόσδεσης εκκινητή, θέση περιορισμού) εμφανίζεται ως αντίστροφο συμπλήρωμα: η συμβολοσειρά αναποδογυρίζεται από άκρο σε άκρο και κάθε βάση αντικαθίσταται με τη σύντροφό της. Παράδειγμα: η αλληλουχία 5′→3′ ATGCGT έχει αντίστροφο συμπλήρωμα ACGCAT — και η εφαρμογή της πράξης δύο φορές επαναφέρει πάντα την αρχική.
Μεταγραφή και μετάφραση
Η μεταγραφή αντιγράφει ένα γονίδιο σε RNA, αντικαθιστώντας τη θυμίνη με ουρακίλη. Η μετάφραση διαβάζει στη συνέχεια το RNA (ή τη κωδική αλυσίδα του DNA) σε κωδικόνια των τριών βάσεων: το ATG ξεκινά μια πρωτεΐνη (μεθειονίνη), τα TAA/TAG/TGA την τερματίζουν. Επειδή το πλαίσιο ανάγνωσης μπορεί να ξεκινά από τη θέση 1, 2 ή 3 σε οποιαδήποτε αλυσίδα, κάθε δίκλωνο DNA προσφέρει έξι πιθανά πλαίσια — και συνήθως μόνο ένα κωδικοποιεί ένα πραγματικό, μακρύ ORF (ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης). Το πάνελ μετάφρασης εμφανίζει και τα έξι, ώστε το αληθινό γονίδιο να φανερώνεται ως το πλαίσιο με καθαρή διαδρομή από την έναρξη έως τον τερματισμό. Επειδή η πολυμεράση διαβάζει την αλυσίδα υποδείγματος, το mRNA καταλήγει να ταιριάζει με την κωδική αλυσίδα με U στη θέση του T.
Περιεκτικότητα GC, Tm και μοριακό βάρος
Τα ζεύγη GC μοιράζονται τρεις δεσμούς υδρογόνου έναντι των δύο του AT, οπότε το DNA πλούσιο σε GC είναι σταθερότερο: τήκεται σε υψηλότερη θερμοκρασία (υψηλότερη Tm), διατηρεί πιο σφιχτές πτυχώσεις, και σε ολόκληρα γονιδιώματα το μερίδιό του είναι ένα είδος-υπογραφή που κυμαίνεται από περίπου 25% έως 75% στα βακτήρια. Το μοριακό βάρος αθροίζει τις μάζες ανά νουκλεοτίδιο (περίπου 330 Da κατά μέσο όρο για μονόκλωνο DNA, διπλάσιο για δίκλωνο με τη συμπληρωματική αλυσίδα). Το πάνελ Χρήση κωδικονίων μετρά ποια από τα συνώνυμα κωδικόνια προτιμά ένα γονίδιο — η έντονα πολωμένη χρήση μπορεί να αποκαλύψει γονίδια με υψηλή έκφραση.
Συνηθισμένες παρανοήσεις
- “Το αντίστροφο συμπλήρωμα είναι απλώς το συμπλήρωμα.” Το συμπλήρωμα μόνο του δίνει συμβολοσειρά 3′→5′· μόνο η αντιστροφή της μετά αποκαθιστά τον συμβατικό προσανατολισμό 5′→3′ που χρησιμοποιούν οι πολυμεράσες και τα εγχειρίδια.
- “Ένα κωδικόνιο τερματισμού σημαίνει το τέλος του γονιδίου.” Σε τυχαίο πλαίσιο, οι τερματισμοί εμφανίζονται τυχαία περίπου κάθε 21 κωδικόνια· ένα πραγματικό ORF κρίνεται από το μήκος και από κατάλληλη έναρξη, όχι από ένα μεμονωμένο στοπ.
- “Η περιεκτικότητα GC είναι απλώς ποσοστό.” Προβλέπει επίσης τη συμπεριφορά πρόσδεσης: ο σχεδιασμός εκκινητών PCR, ο σχεδιασμός ανιχνευτών και η αυστηρότητα υβριδισμού βασίζονται σε αυτή (βλ. Σχεδιαστής εκκινητών).
Σχετικά εργαλεία: Σχεδιαστής εκκινητών (Tm, διμερή, έλεγχος ζεύγους), Ένζυμα περιορισμού (πού πέφτουν οι τομές στην ίδια αλληλουχία) και Βιο υπολογιστές (μάζα, μοριακότητα και αριθμός αντιγράφων από αυτά τα αποτελέσματα MW).
