Τι είναι ένα ένζυμο περιορισμού;
Ένα ένζυμο περιορισμού είναι ένα ζεύγος μοριακών ψαλιδιών που εξελίχθηκαν στα βακτήρια ως ανοσοποιητικό σύστημα: περιπολεί το κύτταρο και κόβει τον εισβάλλοντα DNA (συνήθως ιικό) όπου εμφανιστεί μια συγκεκριμένη σύντομη αλληλουχία, ενώ το δικό του DNA του βακτηρίου προστατεύεται με χημικά σημάδια. Τα ένζυμα περιορισμού Τύπου II που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία αναγνωρίζουν αλληλουχία 4–8 βάσεων και κόβουν σε καθορισμένη θέση μέσα ή δίπλα της — προγραμματιζόμενα ψαλίδια: επιλέγεται η θέση, και είναι γνωστό ακριβώς πού θα πέσει η τομή.
Ο αριθμός που πρέπει να θυμάται κανείς: μια θέση αναγνώρισης 6 βάσεων, όπως το GAATTC του EcoRI, εμφανίζεται τυχαία περίπου μία φορά ανά 46 = 4096 bp τυχαίου DNA. Γι' αυτό η πέψη ενός γονιδιώματος παράγει χιλιάδες θραύσματα, ενώ η πέψη ενός μικρού πλασμιδίου συνήθως παράγει μια χούφτα — όσο μικρότερο το DNA, τόσο λιγότερες θέσεις φέρει.
Θέσεις αναγνώρισης, κολλώδη άκρα και αμβλέα άκρα
Οι περισσότερες θέσεις Τύπου II είναι παλίνδρομες: η αλληλουχία διαβάζεται το ίδιο και στις δύο αλυσίδες (το EcoRI διαβάζει GAATTC είτε κατά μήκος της πάνω είτε της κάτω αλυσίδας). Το EcoRI κόβει ανάμεσα στο G και στο A, αφήνοντας μονόκλωνες προεξοχές AATT — “κολλώδη” άκρα που υβριδίζονται με κάθε άλλη προεξοχή AATT. Ένζυμα όπως το SmaI (CCC^GGG) και το EcoRV κόβουν ευθεία και στις δύο αλυσίδες και αφήνουν αμβλέα άκρα, που μπορούν να συνδεθούν με οποιοδήποτε άλλο αμβλύ άκρο αλλά συνδέονται πολύ λιγότερο αποτελεσματικά. Τα BamHI και BglII αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες αλλά αφήνουν την ίδια προεξοχή GATC, οπότε τα θραύσματά τους μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους, ακόμη κι αν η υβριδική θέση δεν ταιριάζει πλέον με κανένα από τα δύο ένζυμα. Τα BamHI και BglII κόβουν διαφορετικές θέσεις αλλά αφήνουν την ίδια προεξοχή 5′-GATC, οπότε τα θραύσματά τους συνδέονται — το κόλπο πίσω από την αρθρωτή κλωνοποίηση.
Απλή πέψη, διπλή πέψη, χάρτης θραυσμάτων
Η απλή πέψη απαντά στο “πού κόβει αυτό το ένζυμο την αλληλουχία;”· τα θραύσματα που εμφανίζει είναι αυτά που θα φαίνονταν ως ζώνες μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή. Η διπλή πέψη κόβει με δύο ένζυμα ταυτόχρονα — ο τυπικός τρόπος χαρτογράφησης ενός πλασμιδίου, επειδή το συνδυασμένο σύνολο θραυσμάτων προσδιορίζει πού βρίσκονται οι θέσεις κάθε ενζύμου σε σχέση με τις άλλες. Να σημειωθεί ότι ο αναλυτής αυτός αντιμετωπίζει την είσοδο ως γραμμική αλληλουχία: ένα γραμμικό μόριο με N θέσεις τομής δίνει N+1 θραύσματα, ενώ ένα κυκλικό πλασμίδιο με N θέσεις δίνει ακριβώς N θραύσματα.
Εκφυλισμένες θέσεις αναγνώρισης
Ορισμένα ένζυμα διαβάζουν θέσεις που ανέχονται περισσότερες από μία βάση, γραμμένες με γράμματα IUPAC: το BstEII αναγνωρίζει το GGTNACC (N = οποιαδήποτε βάση), το StyI το CCWWGG (W = A ή T). Το πάνελ Αναζήτηση θέσεων δέχεται το ίδιο αλφάβητο, οπότε μπορεί κανείς να σαρώσει οποιαδήποτε αλληλουχία για τέτοια εκφυλισμένα μοτίβα — για παράδειγμα το GANTC, τη θέση του HinfI.
Συνηθισμένες παρανοήσεις
- “Η ίδια θέση αναγνώρισης σημαίνει το ίδιο ένζυμο.” Τα SmaI και XmaI διαβάζουν και τα δύο το
CCCGGG αλλά το κόβουν διαφορετικά (αμβλύ έναντι κολλώδους)· η αλληλουχία αναγνώρισης από μόνη της δεν δείχνει ποτέ τη θέση της τομής.
- “Οι τιμές ρυθμιστικού και θερμικής αδρανοποίησης στη βάση δεδομένων είναι νόμοι.” Είναι τυπικές τιμές των προμηθευτών· τα ρυθμιστικά διαφέρουν ανάμεσα σε προμηθευτές και ορισμένα ένζυμα χρειάζονται ειδικές συνθήκες — ο έλεγχος του ισχύοντος φύλλου δεδομένων πρέπει να γίνεται πάντα πριν από τη ρύθμιση μιας αντίδρασης.
- “Χωρίς θέσεις τομής, το ένζυμο είναι χαλασμένο.” Συχνότερα η θέση υπάρχει αλλά είναι μπλοκαρισμένη — η βακτηριακή μεθυλίωση dam/dcm καλύπτει τα μοτίβα GATC και CCWGG και σταματά αρκετά ένζυμα (το BclI είναι κλασικό θύμα).
Σχετικά εργαλεία: Ανάλυση αλληλουχιών (περιεχόμενο GC και MW του DNA που κόβεται), Σχεδιαστής εκκινητών (ενίσχυση του θραύσματος που επιθυμείται) και Βιο υπολογιστές (πόσο από την πέψη να φορτωθεί).
