Mikä on restriktioentsyymi?
Restriktioentsyymi on pari molekyylisaksia, jonka bakteerit kehittivät immuunijärjestelmäkseen: se partioi solua ja leikkaa tunkeutuvaa DNA:ta (yleensä virukselta) aina, kun yksi tietty lyhyt sekvenssi esiintyy, kun taas bakteerin oma DNA on suojattu kemiallisilla merkeillä. Molekyylibiologiassa käytetyt tyypin II restriktioentsyymit tunnistavat 4–8 emäksen sekvenssin ja leikkaavat määritellystä kohdasta sen sisällä tai vieressä — ohjelmoitavia saksia: valitset kohdan, ja tiedät tarkalleen, mihin leikkaus osuu.
Yksi luku muistettavaksi: 6 emäksen tunnistuskohta, kuten EcoRI:n GAATTC, löytyy sattumalta noin kerran joka 46 = 4096 emäsparin kohdalla satunnaisesta DNA:sta. Siksi genomin hajottaminen tuottaa tuhansia fragmentteja, mutta pienen plasmidin hajottaminen tuottaa yleensä muutaman — mitä lyhyempi DNA, sitä vähemmän kohtia se kantaa.
Tunnistuskohdat, tahmeat päät ja tylpät päät
Useimmat tyypin II kohdat ovat palindromisia: sekvenssi lukee samoin molemmilla juosteilla (EcoRI lukee GAATTC:n, kävitpä ylä- tai alajuostetta pitkin). EcoRI leikkaa G:n ja A:n väliin ja jättää yksijuosteiset AATT-ulokkeet — “tahmeat” päät, jotka liittyvät mihin tahansa toiseen AATT-ulokkeeseen. Entsyymit kuten SmaI (CCC^GGG) ja EcoRV leikkaavat suoraan poikki molemmista juosteista ja jättävät tylpät päät, jotka voidaan liittää mihin tahansa toiseen tylppään päähän mutta liittyvät paljon tehottomammin. BamHI ja BglII tunnistavat eri sekvenssit, mutta jättävät saman GATC-ulokkeen, joten niiden fragmentit voidaan liittää yhteen, vaikka hybridikohta ei vastaa kumpaakaan entsyymiä sen jälkeen. Tämä on modulaarisen kloonauksen temppu.
Yksinkertainen hajotus, kaksoishajotus, fragmenttikartta
Yksi hajotus vastaa kysymykseen “mihin tämä entsyymi leikkaa sekvenssini?”; sen listaamat fragmentit ovat ne, jotka näkisit vyönä geelielektroforeesin jälkeen. Kaksoishajotus leikkaa kahdella entsyymillä kerralla — tavallinen tapa kartoittaa plasmidi, koska yhdistetty fragmenttijoukko kiinnittää, missä kunkin entsyymin kohdat sijaitsevat toisiinsa nähden. Huomaa, että tämä analysaattori käsittelee syötteen lineaarisena sekvenssinä: lineaarinen molekyyli, jossa on N leikkauskohtaa, antaa N+1 fragmenttia, kun taas ympyrän muotoinen plasmidi, jossa on N kohtaa, antaa tasan N fragmenttia.
Rappeutuneet tunnistuskohdat
Jotkin entsyymit lukevat kohtia, jotka sietävät useampaa kuin yhtä emästä, kirjoitettuna IUPAC-kirjaimilla: BstEII tunnistaa GGTNACC:n (N = mikä tahansa emäs), StyI tunnistaa CCWWGG:n (W = A tai T). Kohdehaku-paneeli hyväksyy saman aakkoston, joten voidaan etsiä mistä tahansa sekvenssistä tällaisia rappeutuneita kuvioita itse — esimerkiksi GANTC, HinfI:n kohta.
Yleisiä väärinkäsityksiä
- “Sama tunnistuskohta tarkoittaa samaa entsyymiä.” SmaI ja XmaI lukevat molemmat
CCCGGG:n, mutta leikkaavat sen eri tavalla (tylpästi vs. tahmeasti); pelkkä tunnistussekvenssi ei kerro leikkauskohtaa.
- “Tietokannan puskuri- ja lämpöinaktivointiarvot ovat lakeja.” Ne ovat tyypillisiä valmistajan arvoja; puskurit eroavat toimittajien välillä ja jotkin entsyymit tarvitsevat erityisolosuhteita — tarkista aina ajantasainen tuotetieto ennen reaktion asettamista.
- “Ei leikkauskohtia tarkoittaa, että entsyymi on rikki.” Useammin kohta on olemassa mutta estynyt — bakteerien dam/dcm-metylaatio peittää GATC- ja CCWGG-motiivit ja pysäyttää useita entsyymejä (BclI on klassinen uhri).
Aiheeseen liittyvät työkalut: Sekvenssianalyysi (leikattavan DNA:n GC-pitoisuus ja moolipaino), Alukesuunnittelu (haluamasi fragmentin monistaminen) ja Bio-laskurit (kuinka paljon hajotetta ladata).
