Mitä DNA-sekvenssianalyysi oikeastaan laskee?
DNA on neljän kirjaimen ketju, jolla on kaksi hankalaa ominaisuutta: kaksi juostetta kulkevat vastakkaisiin suuntiin, ja viesti on luettavissa vain kolmen emäksen lohkoina. Lähes jokainen tämän sivun paneeli käsittelee jompaakumpaa näistä seikoista — juosteen suuntaa (käänteinen komplementti, transkriptio) tai kolmoskoodia (translaatio, lukukehykset). Loput paneelit mittaavat fysikaalisia ominaisuuksia (GC-pitoisuus, sulamislämpötila, moolimassa), jotka seuraavat itse kirjaimista.
Yksi luku muistettavaksi: geneettisessä koodissa on 64 kodonia (4×4×4), mutta vain 20 aminohappoa ja lopetuskodonit — koodi on degeneroitunut, joten useat eri kodonit (esim. CTT, CTC, CTA ja CTG koodaavat kaikki leusiinia) määrittävät saman tähteen. Tämä redundanssi selittää, miksi hiljainen mutaatio voi muuttaa sekvenssiä muuttamatta proteiinia.
Käänteinen komplementti: toisen juosteen lukeminen
DNA:n kaksi juostetta ovat antiparalleeleja, ja A pariutuu T:n kanssa sekä C G:n kanssa. Jos sekvenssi on ylemmällä juosteella, kaikki alemmalla juosteella toimiva (geeni, alukkeen sitoutumiskohta, restriktiokohta) näkyy käänteisenä komplementtina: käännä merkkijono päästä päähän ja vaihda jokainen emäs sen pariin. Esimerkki: 5′→3′-sekvenssin ATGCGT käänteinen komplementti on ACGCAT — ja kun toiminto tehdään kahdesti, tulos on aina alkuperäinen.
Transkriptio ja translaatio
Transkriptio kopioi geenin RNA:ksi vaihtamalla tymiinin urasiiliksi. Translaatio lukee sitten RNA:ta (tai DNA:n koodaavaa juostetta) kodoneina, eli kolmen emäksen ryhminä: ATG aloittaa proteiinin (metioniini), ja TAA/TAG/TGA lopettavat sen. Koska lukukehys voi alkaa kohdasta 1, 2 tai 3 kummalla tahansa juosteella, kaksijuosteisesta DNA:sta on kuusi mahdollista kehystä — ja tyypillisesti vain yksi niistä koodaa todellista, pitkää ORF:ää (avoin lukukehys). Translaatiopaneeli näyttää kaikki kuusi, jotta todellinen geeni paljastuu kehyksenä, jossa on siisti jakso aloituksesta lopetukseen. Koska polymeraasi lukee mallijuostetta, mRNA vastaa koodaavaa juostetta, jossa T on korvattu U:lla.
GC-pitoisuus, Tm ja moolimassa
GC-pareissa on kolme vetysidosta AT-parin kahden sijaan, joten GC-rikas DNA on vakaampaa: se sulaa korkeammassa lämpötilassa (korkeampi Tm), pitää kiinni tiukemmista rakenteista, ja koko genomeissa sen osuus on lajikohtainen tunnus, joka vaihtelee bakteereilla noin 25 %:sta 75 %:iin. Moolimassa lasketaan nukleotidikohtaisten massojen summana (yksijuosteisen DNA:n keskiarvo noin 330 Da, kaksijuosteisella kaksinkertainen komplementtijuosteen kanssa). Kodonien käyttö -paneeli laskee, mitä synonyymejä kodoneja geeni suosii — voimakkaasti vinoutunut käyttö voi paljastaa runsaasti ilmentyviä geenejä.
Yleisiä väärinkäsityksiä
- “Käänteinen komplementti on pelkkä komplementti.” Pelkkä komplementointi antaa 3′→5′-merkkijonon; vasta järjestyksen kääntäminen palauttaa tavanomaisen 5′→3′-suunnan, jota polymeraasit ja oppikirjat käyttävät.
- “Lopetuskodoni tarkoittaa geenin loppua.” Satunnaisessa lukukehyksessä lopetuskodonit esiintyvät sattumalta noin 21 kodonin välein; avoin lukukehys (ORF) arvioidaan pituuden ja kunnollisen aloituksen perusteella, ei yksittäisen lopetuskodonin.
- “GC-pitoisuus on vain prosenttiluku.” Se ennustaa myös kiinnittymiskäyttäytymistä: PCR-alukkeiden suunnittelu, koettimien suunnittelu ja hybridisaation tiukkuus nojaavat kaikki siihen (katso Alukesuunnittelu).
Aiheeseen liittyvät työkalut: Alukesuunnittelu (Tm, dimeerit, parin tarkistus), Restriktioentsyymit (mihin leikkaukset osuvat samassa sekvenssissä) ja Bio-laskurit (massa, molaarisuus ja kopiomäärä näistä MW-tuloksista).
