Mi a mól — és miért fut rajta az oldal minden panele?
A molekuláris biológia egyetlen kérdést tesz fel különböző jelmezekben: hány molekula van valójában? A mérleg grammot mutat, a spektrofotométer abszorbanciát, a pipetta mikroliter-térfogatot mér — a reakciók viszont a mólt számolják, a vegyészek egységét, amelyben egy mólnyi 6,022×10²³ molekula van. A molekulatömeg (daltonban, számszerűen megegyezik a g/mol értékkel) a váltószám a lemérhető és a megszámolható között. A fenti minden panel — MW, Mass↔Moles, OD260, hígítás, másolatszám, extinkciós együttható — egy lépés ezen az átváltáson.
Az egy megjegyzendő szám: 1 µg, 1000 bp hosszú kettős szálú DNS kb. 9,1×10¹¹ molekulát tartalmaz. Nem elírás — a pipettázott mennyiségek molekuláris léptékben csillagászatilag nagyok, ezért fontos ennyire a tömeg, a koncentráció és a másolatszám közötti átváltás.
Tömeg, mólok és molaritás
A Mass↔Moles panel a grammokat g/mol-lal osztja, így mólokat kapunk, a mólokat pedig literrel osztja, így molaritást. Kidolgozott példa: 1 mg, 50 kDa fehérje 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; 1 mL-ben oldva ez 20 µM oldat. A genomi DNS gyakran mikrogrammban, az oligók és a plazmid-preparátumok pmol-ban kerülnek szóba, a Mértékegység-átalakítás panel pedig ezeknek a prefixumoknak mindegyike között közvetít.
OD260: koncentráció mérlegelés nélkül
A nukleinsavak 260 nm-en nyelik el az UV-fényt a Beer–Lambert-törvény szerint (abszorbancia = extinkció × koncentráció × úthossz), így a spektrofotométer helyettesítheti a mérleget. 1 cm-es úthossznál egy abszorbanciaegység nagyjából 50 µg/mL kettős szálú DNS-nek, 40 µg/mL RNS-nek vagy 33 µg/mL egyszálú DNS-nek felel meg. Az opcionális A280-as mérés tisztasági heurisztikát ad: a tiszta DNS A260/A280 hányadosa 1,8 körül van, a tiszta RNS-é 2,0 körül; az alacsony hányados általában fehérjét vagy fenolt jelez. A DNS-preparátumban az 1,8 jóval feletti hányados az ellenkező irányba mutat: RNS-szennyezés.
Hígítás: C₁V₁ = C₂V₂
A hígítási képlet egyszerűen az oldott anyag megmaradása: a törzsoldatból kivett mólok megegyeznek a leadott mólokkal. 100 mL végtérfogatban a 100 mg/mL törzsből 10 mg/mL-t készítve: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL törzsoldat és 90 mL oldószer, tízszeres hígítás. A Pufferkészítés panel ugyanezt a számítást végzi a “50×” vagy “10×” törzstényezőkkel — 1 L 1× TAE készítéséhez 50×-es törzsből 1000/50 = 20 mL törzsoldat kell.
Másolatszám és extinkciós együtthatók
Mivel a plazmid minden példányának azonos a molekulatömege (kettős szálú DNS-nél kb. 660 Da bázispáronként), a tömeg Avogadro-számon keresztül alakul molekulaszámmá: 1 µg, 5000 bp hosszú plazmid nagyjából 1,8×10¹¹ másolat, és bármely anyag 1 pmol-ja 6,02×10¹¹ másolat. Fehérjéknél az Edelhoch-módszer 280 nm-es abszorbanciát mindössze három maradéktípusból jósol meg: minden triptofán 5690 M⁻¹cm⁻¹-t, minden tirozin 1280-at, minden cisztin (diszulfid) 120-at ad hozzá. Az aromás maradékot nem tartalmazó fehérje UV-ben szinte láthatatlan — ezért inkább mérlegelni kell.
Gyakori félreértések
- „Az 1-es OD pontos állandó.” Az 50/40/33 µg/mL tényezők hosszú polimerekre vonatkozó empirikus átlagok; a bázisösszetétel, a só és főleg a rövid oligonukleotidok eltolják őket.
- „A bázispáronként 660 Da természeti törvény.” Kényelmes átlag — az AT- és GC-gazdag DNS kissé eltér, és a sókörülmények számítanak. Kettőnél több értékes jegyben nem érdemes bízni.
- „Az A260/A280 1,6 tönkreteszi a mintát.” A hányados szűrési heurisztika, érzékeny a pH-ra és a pufferre; inkább jelzésnek kell tekinteni, nem ítéletnek.
- „A másolatok és a pmol felcserélhetők.” 6,02×10¹¹-szeres tényezővel térnek el; a kettő összekeverése klasszikus qPCR-összeállítási hiba.
Kapcsolódó eszközök: a Moláris tömeg számító (az MW-panel kémiai párja), az Oldatok és hígítás, a Szekvenciaelemzés, és a Genetikai számológép.
