Mit számol valójában a DNS-szekvenciaelemzés?
A DNS négy betűből álló lánc két kényelmetlen tulajdonsággal: a két szál ellentétes irányban fut, és az üzenet csak hármas blokkokban olvasható. Az oldal szinte minden panelje e két tény egyikével foglalkozik — a szálirányítással (fordított komplement, transzkripció) vagy a hármas kóddal (transzláció, olvasási keretek). A többi panel fizikai tulajdonságokat mér (GC-tartalom, olvadási hőmérséklet, molekulatömeg), amelyek magukból a betűkből következnek.
Az egy megjegyzendő szám: a genetikai kód 64 kodont (4×4×4) tartalmaz, de csak 20 aminosavat és a stop-jeleket — a kód degenerált, ezért több különböző kodon (pl. CTT, CTC, CTA, CTG, mind leucint olvas) ugyanazt a maradékot írja le. Ez a redundancia az oka annak, hogy egy csendes mutáció megváltoztathatja a szekvenciát anélkül, hogy a fehérjét megváltoztatná.
Fordított komplement: a másik szál olvasása
A DNS két szála antiparallel: az A a T-vel, a C a G-vel párosodik. Ha a szekvencia a felső szálon van, minden, ami az alsó szálon működik (egy gén, egy primer-kötőhely, egy restrikciós hely), a fordított komplement alakjában jelenik meg: a sztring végétől a végéig megfordítva, és minden bázis a párjára cserélve. Példa: az 5′→3′ ATGCGT szekvencia fordított komplementje ACGCAT — és a műveletet kétszer alkalmazva mindig visszakapjuk az eredetit.
Transzkripció és transzláció
A transzkripció egy gént RNS-be másol, a timint uracillal helyettesítve. A transzláció ezután az RNS-t (vagy a DNS kódoló szálat) három bázisú kodonokban olvassa: az ATG egy fehérjét indít (metionin), az TAA/TAG/TGA pedig leállítja. Mivel az olvasási keret bármelyik szálon az 1., 2. vagy 3. pozícióról indulhat, bármely kettős szálú DNS hat lehetséges keretet kínál — és általában csak egy kódol valódi, hosszú ORF-et (nyitott olvasási keretet). A transzlációs panel mind a hatot megmutatja, így a valódi gén az a keret lesz, amelynek egy tiszta szakasza kezdettől stop-ig tart. Mivel a polimeráz a templátszálat olvassa, az mRNS a T helyett U-val a kódoló szállal egyezik meg.
GC-tartalom, Tm és molekulatömeg
A GC-párok három hidrogénkötést osztanak meg az AT-párok kettőjével szemben, ezért a GC-gazdag DNS stabilabb: magasabb hőmérsékleten olvad (magasabb Tm), szorosabb hajtogatást tart, és teljes genomokban az aránya fajspecifikus jel, amely a baktériumok között nagyjából 25%-tól 75%-ig terjed. A molekulatömeg a nukleotidonkénti tömegeket összegzi (egyszálú DNS-nél átlagosan kb. 330 Da, kettős szálnál a komplementer szállal együtt kétszerese). A kodonhasználat panel számolja, hogy egy gén a szinonim kodonok közül melyiket részesíti előnyben — az erősen torzított használat a magasan expresszált géneket leleplezheti.
Gyakori félreértések
- „A fordított komplement csak a komplement.” A puszta komplementálás 3′→5′ sztringet ad; csak az utána következő megfordítás állítja vissza a hagyományos 5′→3′ irányt, amelyet a polimerázok és a tankönyvek használnak.
- „A stop-kodon a gén végét jelenti.” Véletlenszerű keretben a stop-jelek körülbelül 21 kodonként véletlenül megjelennek; egy valódi ORF-et a hossza és a megfelelő kezdete alapján ítélnek meg, nem egyetlen stop-jel alapján.
- „A GC-tartalom csak egy százalék.” A hibridizációs viselkedést is előrejelzi: a PCR-primertervezés, a szondatervezés és a hibridizációs szigorúság mind erre támaszkodik (részletek: Primertervező).
Kapcsolódó eszközök: a Primertervező (Tm, dimerek, párellenőrzés), a Restrikciós enzimek (hol esnek a vágások ugyanabban a szekvenciában), és a Bio számológépek (tömeg, molaritás és másolatszám ezekből az MW-eredményekből).
