Mi a restrikciós enzim?
A restrikciós enzim molekuláris olló, amelyet a baktériumok immunrendszerként fejlesztettek ki: a sejtben járőrözve ott vágja el a betolakodó DNS-t (általában vírusból származót), ahol egy adott rövid szekvencia megjelenik, míg a baktérium saját DNS-ét kémiai jelek védik. A molekuláris biológiában használt II. típusú restrikciós enzimek 4–8 bázisos szekvenciát ismernek fel, és azon belül vagy mellette meghatározott pozícióban vágnak — programozható olló: a felismerőhely megválasztásával pontosan tudható, hol esik a vágás.
Az egy megjegyzendő szám: egy 6 bázisos felismerőhely, mint az EcoRI GAATTC-ja, véletlenül nagyjából 46 = 4096 bp véletlenszerű DNS-enként fordul elő. Ezért ad egy genom több ezer fragmentumot, míg egy kis plazmid emésztése általában néhányat — minél rövidebb a DNS, annál kevesebb felismerőhelyet hordoz.
Felismerőhelyek, tapadó és tompa végek
A legtöbb II. típusú felismerőhely palindrom: a szekvencia mindkét szálon ugyanúgy olvasódik (az EcoRI GAATTC-t olvas, akár a felső, akár az alsó szálon haladunk). Az EcoRI a G és az A között vág, egyszálú AATT túlnyúlást hagyva — „tapadó” végeket, amelyek bármely más AATT túlnyúláshoz kapcsolódnak. Az olyan enzimek, mint a SmaI (CCC^GGG) és az EcoRV, mindkét szálon egyenesen vágnak és tompa végeket hagynak, amelyek bármely más tompa véghez köthetők, de sokkal kisebb hatásfokkal ligálódnak. A BamHI és a BglII más szekvenciákat ismer fel, mégis azonos GATC túlnyúlást hagy, így a fragmentumaik akkor is ligálhatók egymáshoz, ha a hibrid hely utána egyik enzimnek sem felel meg. A BamHI és a BglII más helyeket vág, de azonos 5′-GATC túlnyúlást hagy, így fragmentumaik ligálódnak — ez a moduláris klónozás trükkje.
Egyszeres emésztés, kettős emésztés, fragmenttérkép
Az egyszeres emésztés arra válaszol: „hol vágja ez az enzim a szekvenciámat?”; a listázott fragmentumok azok a sávok, amelyeket gélelektroforézis után látnánk. A kettős emésztés két enzimmel egyszerre vág — ez a plazmid térképezésének szokásos módja, mert a kombinált fragmentumkészlet rögzíti, hogy az egyes enzimek helyei egymáshoz képest hol vannak. Megjegyzendő, hogy ez az elemző a bemenetet lineáris szekvenciaként kezeli: N vágási helyet tartalmazó lineáris molekula N+1 fragmentumot ad, míg egy N helyet tartalmazó cirkuláris plazmid pontosan N fragmentumot.
Degenerált felismerőhelyek
Egyes enzimek olyan pozíciókat olvasnak, amelyek egynél több bázist tűrnek, IUPAC-betűkkel jelölve: a BstEII a GGTNACC-t ismeri fel (N = bármely bázis), a StyI a CCWWGG-t (W = A vagy T). A Helykeresés panel ugyanezt az ábécét fogadja el, így bármely szekvencia átvizsgálható ilyen degenerált mintákra — például a GANTC-re, a HinfI helyére.
Gyakori félreértések
- „Ugyanaz a felismerőhely, ugyanaz az enzim.” A SmaI és a XmaI is
CCCGGG-t olvas, de másképp vágja (tompa vs. tapadó); a felismerőszekvencia önmagában sosem mondja meg a vágás helyzetét.
- „Az adatbázis puffer- és hőinaktiválási értékei törvények.” Tipikus gyártói értékek; a pufferek beszállítónként eltérnek, és néhány enzimhez speciális körülmények kellenek — reakció összeállítása előtt mindig az aktuális adatlapot kell ellenőrizni.
- „A vágási helyek hiánya azt jelenti, hogy az enzim sérült.” Gyakrabban a hely megvan, de blokkolva van — a bakteriális dam/dcm metiláció a GATC és CCWGG motívumokra telepszik, és több enzimet megállít (a BclI a klasszikus áldozat).
Kapcsolódó eszközök: a Szekvenciaelemzés (a vágott DNS GC-tartalma és MW-je), a Primertervező (a kívánt fragmentum amplifikálásához), és a Bio számológépek (az emésztmény mennyiségének meghatározásához).
