Apa itu enzim restriksi?
Enzim restriksi adalah sepasang gunting molekuler yang dikembangkan bakteri sebagai sistem imun: ia berpatroli di dalam sel dan memotong DNA penyusup (biasanya dari virus) di mana pun satu urutan pendek tertentu muncul, sementara DNA bakteri sendiri terlindungi oleh tanda kimia. Enzim restriksi Tipe II yang digunakan dalam biologi molekuler mengenali urutan 4–8 basa dan memotong pada posisi tertentu di dalam atau di samping urutan itu — gunting yang dapat diprogram: pilih situsnya, dan posisi potongan akan diketahui persis.
Satu angka yang perlu diingat: situs pengenalan 6-basa seperti GAATTC milik EcoRI muncul secara kebetulan sekitar sekali setiap 46 = 4096 bp DNA acak. Itulah sebabnya digesti genom menghasilkan ribuan fragmen tetapi digesti plasmid kecil biasanya hanya menghasilkan beberapa — semakin pendek DNA-nya, semakin sedikit situsnya.
Situs pengenalan, ujung lengket, dan ujung tumpul
Sebagian besar situs Tipe II bersifat palindrom: urutannya sama dibaca pada kedua untai (EcoRI membaca GAATTC baik saat menelusuri untai atas maupun bawah). EcoRI memotong di antara G dan A, meninggalkan tonjolan untai tunggal AATT — ujung “lengket” yang menempel pada tonjolan AATT lain mana pun. Enzim seperti SmaI (CCC^GGG) dan EcoRV memotong lurus melintasi kedua untai dan meninggalkan ujung tumpul, yang dapat disambung ke ujung tumpul lain tetapi jauh lebih tidak efisien. BamHI dan BglII mengenali urutan yang berbeda tetapi sama-sama meninggalkan tonjolan GATC yang sama, sehingga fragmennya dapat disambung meski situs hibrida yang dihasilkan tidak cocok dengan kedua enzim itu setelahnya. BamHI dan BglII memotong situs yang berbeda tetapi meninggalkan tonjolan 5′-GATC yang sama, sehingga fragmennya tersambung — trik di balik kloning modular.
Digesti tunggal, digesti ganda, peta fragmen
Digesti tunggal menjawab “di mana enzim ini memotong urutan ini?”; fragmen yang didaftarkannya adalah pita yang akan terlihat setelah elektroforesis gel. Digesti ganda memotong dengan dua enzim sekaligus — cara standar untuk memetakan plasmid, karena kumpulan fragmen gabungan menentukan posisi situs masing-masing enzim relatif satu sama lain. Perhatikan bahwa penganalisis ini memperlakukan input sebagai urutan linear: molekul linear dengan N situs potong menghasilkan N+1 fragmen, sedangkan plasmid sirkular dengan N situs menghasilkan tepat N fragmen.
Situs pengenalan degenerat
Beberapa enzim membaca posisi yang mentolerir lebih dari satu basa, ditulis dengan huruf IUPAC: BstEII mengenali GGTNACC (N = basa apa pun), StyI mengenali CCWWGG (W = A atau T). Panel Pencarian Situs menerima abjad yang sama, sehingga pola degenerat seperti itu dapat dipindai pada urutan apa pun — misalnya GANTC, situs HinfI.
Kesalahpahaman umum
- “Situs pengenalan yang sama berarti enzim yang sama.” SmaI dan XmaI sama-sama membaca
CCCGGG tetapi memotongnya dengan cara berbeda (tumpul vs. lengket); urutan pengenalan saja tidak pernah memberi tahu posisi pemotongan.
- “Buffer basis data dan nilai inaktivasi panas adalah hukum.” Itu nilai tipikal dari pemasok; buffer berbeda antar pemasok dan beberapa enzim membutuhkan kondisi khusus — selalu periksa lembar data terkini sebelum menyiapkan reaksi.
- “Tidak ada situs potong berarti enzimnya rusak.” Lebih sering situsnya ada tetapi terblokir — metilasi dam/dcm bakteri menutupi motif GATC dan CCWGG dan menghentikan beberapa enzim (BclI adalah korban klasik).
Alat terkait: Analisis Urutan (kandungan GC dan MW DNA yang sedang dipotong), Perancang Primer (memperbanyak fragmen yang diinginkan), dan Kalkulator Bio (berapa banyak digesti yang dimuat).
