Grunnleggende biokjemiske beregninger — molekylvekt, konvertering fra masse til mol, bestemmelse av A260-konsentrasjon, C1V1-fortynning, kopitall, proteinets ekstinksjonskoeffisient, bufferoppskrifter og enhetskonvertering. Se også: Sekvensanalyse | Genetikkalkulator.
Skriv inn en DNA-/RNA-sekvens, en proteinsekvens (enkeltbokstavkode) eller en kjemisk formel for å beregne molekylvekten.
Skriv inn molekylvekt og masse for å beregne mol, eller mol for å beregne massen som trengs for et målvolum og en målkonsentrasjon.
Skriv inn A260-avlesning for å beregne konsentrasjonen av nukleinsyre. Valgfritt kan man skrive inn A280 for renhetsforholdet (A260/A280).
Bruk formelen C₁V₁ = C₂V₂ for å beregne fortynninger. Skriv inn stamkonsentrasjon, målkonsentrasjon og målvolum.
Skriv inn malens lengde og masse for å beregne antall DNA-/RNA-kopier.
Skriv inn en proteinsekvens for å beregne ekstinksjonskoeffisienten ved 280 nm med Edelhoch-metoden (bidrag fra Trp, Tyr, Cys).
×
Velg en buffer og skriv inn målvolumet for å få oppskriften for fremstillingen.
Velg en kategori og enheter for å utføre vanlige enhetskonverteringer i biokjemi.
Referanser: A260-omregningsfaktorer: dsDNA = 50 µg/mL, ssDNA = 33 µg/mL, RNA = 40 µg/mL per 1,0 OD. Gjennomsnittlig nukleotid-MW: ca. 330 Da (dsDNA). Proteinekstinksjon ved 280 nm: Trp = 5690, Tyr = 1280, Cys (cystin) = 120 M⁻¹cm⁻¹. Bufferoppskrifter basert på standard protokoller i molekylærbiologi (Sambrook & Russell).
Hva er en mol — og hvorfor styrer den alle panelene på denne siden?
Molekylærbiologi stiller hele tiden ett spørsmål i ulik drakt: hvor mange molekyler har jeg egentlig? En vekt leser gram, et spektrofotometer leser absorbans, en pipette måler mikroliter — men reaksjoner teller mol, kjemikernes enhet på 6,022×10²³ molekyler per mol. Molekylvekt (i dalton, numerisk det samme som g/mol) er vekslingskursen mellom det man kan veie og det man kan telle. Hvert panel over — MW, Masse↔Mol, OD260, Fortynning, Kopitall, Ekstinksjonskoeffisient — er ett steg på den vekslingen.
Det ene tallet å huske: 1 µg dobbeltrådet DNA på 1000 bp inneholder omtrent 9,1×10¹¹ molekyler. Ikke en skrivefeil — mengdene man pipetterer er astronomisk store på molekylær skala, og derfor betyr det så mye å konvertere mellom masse, konsentrasjon og kopitall.
Masse, mol og molaritet
Masse↔Mol-panelet deler gram på g/mol for å få mol, og deler mol på liter for å få molaritet. Arbeidseksempel: 1 mg av et protein på 50 kDa er 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; løst i 1 mL er det en 20 µM-løsning. Genomisk DNA omtales ofte i mikrogram, oligoer og plasmidpreparater i pmol, og Enhetskonv.-panelet veksler mellom alle disse prefiksene.
OD260: konsentrasjon uten å veie
Nukleinsyrer absorberer UV ved 260 nm etter Beer–Lamberts lov (absorbans = ekstinksjon × konsentrasjon × banelengde), så et spektrofotometer kan erstatte en vekt. For en banelengde på 1 cm tilsvarer én absorbansenhet omtrent 50 µg/mL dobbeltrådet DNA, 40 µg/mL RNA, eller 33 µg/mL enkeltrådet DNA. Den valgfrie A280-avlesningen gir en renhetsheuristikk: rent DNA ligger nær et A260/A280-forhold på 1,8 og rent RNA nær 2,0; et lavt forhold betyr vanligvis at protein eller fenol har hengt med. Et forhold langt over 1,8 i et DNA-preparat peker den andre veien: RNA har hengt med.
Fortynning: C₁V₁ = C₂V₂
Fortynningsformelen er ganske enkelt bevaring av oppløst stoff: molene man tar fra stamløsningen er lik molene man leverer. For å gå fra en stamløsning på 100 mg/mL til 10 mg/mL i et sluttvolum på 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL stamløsning pluss 90 mL løsningsmiddel, en tifold fortynning. Bufferfremstillings-panelet kjører den samme aritmetikken med stamfaktorene «50×» eller «10×» — å lage 1 L 1× TAE fra en 50×-stamløsning krever 1000/50 = 20 mL stamløsning.
Kopitall og ekstinksjonskoeffisienter
Fordi hver kopi av et plasmid har samme molekylvekt (omtrent 660 Da per basepar for dsDNA), konverteres masse til antall molekyler via Avogadros tall: 1 µg av et plasmid på 5000 bp er omtrent 1,8×10¹¹ kopier, og 1 pmol av hva som helst er 6,02×10¹¹ kopier. For proteiner forutsier Edelhoch-metoden absorbansen ved 280 nm fra bare tre restypersler: hvert tryptofan bidrar med 5690 M⁻¹cm⁻¹, hvert tyrosin 1280, hvert cystin (disulfid) 120. Et protein uten aromatiske rester er nesten usynlig for UV — vei det i stedet.
Vanlige misforståelser
“Én OD er en eksakt konstant.” Faktorene 50/40/33 µg/mL er empiriske gjennomsnitt for lange polymerer; basesammensetning, salt og særlig korte oligonukleotider forskyver dem.
“660 Da per basepar er en naturlov.” Det er et praktisk gjennomsnitt — AT- og GC-rikt DNA skiller seg litt, og saltforhold betyr noe. Stol ikke på mer enn to gjeldende siffer.
“En A260/A280 på 1,6 ødelegger prøven min.” Forholdet er en screeningsheuristikk, følsom for pH og buffer; behandle det som et flagg, ikke en dom.
“Kopier og pmol er utskiftbare.” De skiller seg med en faktor på 6,02×10¹¹; å blande dem sammen er en klassisk oppsettfeil i qPCR.
