Hva beregner egentlig DNA-sekvensanalyse?
DNA er en kjede av fire bokstaver med to upraktiske egenskaper: de to trådene løper i motsatt retning, og budskapet kan bare leses i blokker på tre. Nesten hvert panel på denne siden finnes for å håndtere en av de to fakta — trådorientering (revers komplement, transkripsjon) eller tripletkoden (translasjon, leserammer). De øvrige panelene måler fysiske egenskaper (GC-innhold, smeltetemperatur, molekylvekt) som følger av selve bokstavene.
Det ene tallet å huske: den genetiske koden har 64 kodoner (4×4×4), men bare 20 aminosyrer pluss stopp — koden er degenerert, så flere ulike kodoner (f.eks. CTT, CTC, CTA, CTG leses alle som leucin) staver den samme resten. Det er denne redundansen som gjør at en stille mutasjon kan endre en sekvens uten å endre et protein.
Revers komplement: å lese den andre tråden
DNA-ets to tråder er antiparallelle, og A parer seg med T, C med G. Hvis sekvensen står på den øvre tråden, vises alt som virker på den nedre tråden (et gen, et primerbindingssete, et restriksjonssete) som revers komplement: snu strengen fra ende til ende og bytt hver base med sin partner. Eksempel: 5′→3′-sekvensen ATGCGT har revers komplement ACGCAT — og å bruke operasjonen to ganger gir alltid den opprinnelige.
Transkripsjon og translasjon
Transkripsjon kopierer et gen til RNA og bytter tymin med uracil. Translasjon leser deretter RNA-et (eller DNA-ets kodende tråd) i kodoner på tre baser: ATG starter et protein (metionin), TAA/TAG/TGA stopper det. Fordi leserammen kan starte på posisjon 1, 2 eller 3 på hver tråd, gir enhver dobbelttrådet DNA seks mulige rammer — og vanligvis koder bare én for et ekte, langt ORF (åpen leseramme). Translasjonspanelet viser alle seks, slik at det virkelige genet røper seg som rammen med en ren strekning fra start til stopp. Fordi polymerasen leser malkjeden, ender mRNA-et opp med å stemme med den kodende tråden, med U i stedet for T.
GC-innhold, Tm og molekylvekt
GC-par deler tre hydrogenbindinger mot AT-parenes to, så GC-rikt DNA er mer stabilt: det smelter varmere (høyere Tm), holder tettere folder, og i hele genomer er andelen et artskjennetegn som varierer fra omtrent 25 % til 75 % blant bakterier. Molekylvekten summerer massene til hvert nukleotid (omtrent 330 Da i snitt for enkelttrådet DNA, dobbelt for en dupleks med den komplementære tråden). Kodonbruk-panelet teller hvilke av de synonyme kodonene et gen foretrekker — sterkt skjev bruk kan avsløre gener som uttrykkes kraftig.
Vanlige misforståelser
- “Det reverse komplementet er bare komplementet.” Å komplementere alene gir en streng 3′→5′; først når den også reverseres, gjenopprettes den vanlige 5′→3′-orienteringen som polymeraser og lærebøker bruker.
- “Et stoppkodon betyr slutten på genet.” I en tilfeldig leseramme dukker stopp opp tilfeldig omtrent hver 21. kodon; et ekte ORF vurderes etter lengde og en riktig start, ikke etter ett enkelt stoppkodon.
- “GC-innhold er bare en prosentandel.” Det forutsier også hvordan tråder binder seg: PCR-primerdesign, probedesign og stringens ved hybridisering bygger alle på det (se Primerdesigner).
Relaterte verktøy: Primerdesigner (Tm, dimerer, parkontroll), Restriksjonsenzymer (hvor kuttene faller i samme sekvens) og Bio-kalkulatorer (masse, molaritet og kopitall fra disse MW-resultatene).
