Hva er et restriksjonsenzym?
Et restriksjonsenzym er et par molekylære sakser som bakterier har utviklet som immunsystem: det patruljerer cellen og kutter innvandrende DNA (vanligvis fra et virus) der en bestemt kort sekvens dukker opp, mens bakteriens eget DNA er beskyttet av kjemiske merker. Type II-restriksjonsenzymene som brukes i molekylærbiologi gjenkjenner en sekvens på 4–8 baser og kutter på en bestemt posisjon i eller ved siden av den — programmerbare sakser: velg setet, og man vet nøyaktig hvor kuttet havner.
Det ene tallet å huske: et gjenkjenningssete på 6 baser, som EcoRIs GAATTC, dukker tilfeldig opp omtrent én gang per 46 = 4096 bp tilfeldig DNA. Derfor gir spalting av et genom tusenvis av fragmenter, mens spalting av et lite plasmid vanligvis gir en håndfull — jo kortere DNA, desto færre seter bærer det.
Gjenkjenningssete, klebrige ender og stumpe ender
De fleste Type II-seter er palindromiske: sekvensen leses likt på begge trådene (EcoRI leser GAATTC enten man går langs øvre eller nedre tråd). EcoRI kutter mellom G og A og etterlater enkelttrådede AATT-overheng — «klebrige» ender som binder seg til ethvert annet AATT-overheng. Enzymer som SmaI (CCC^GGG) og EcoRV kutter rett over begge trådene og etterlater stumpe ender, som kan festes til en hvilken som helst annen stump ende, men ligeres langt mindre effektivt. BamHI og BglII gjenkjenner ulike sekvenser, men etterlater det samme GATC-overhenget, så fragmentene deres kan ligeres sammen, selv om det hybride setet ikke samsvarer med noen av enzymene etterpå. Det er trikset bak modulær kloning.
Enkel spalting, dobbel spalting, fragmentkart
En enkel spalting svarer på «hvor kutter dette enzymet sekvensen min?»; fragmentene det lister er det man ser som bånd etter gelelektroforese. En dobbel spalting kutter med to enzymer samtidig — den vanlige måten å kartlegge et plasmid på, fordi det kombinerte fragmentsettet fastslår hvor hvert enzyms seter ligger i forhold til hverandre. Merk at denne analysatoren behandler inndataene som en lineær sekvens: et lineært molekyl med N kuttseter gir N+1 fragmenter, mens et sirkulært plasmid med N seter gir nøyaktig N fragmenter.
Degenererte gjenkjenningssete
Noen enzymer leser posisjoner som tåler mer enn én base, skrevet med IUPAC-bokstaver: BstEII gjenkjenner GGTNACC (N = hvilken som helst base), StyI gjenkjenner CCWWGG (W = A eller T). Søk-etter-sete-panelet godtar det samme alfabetet, så man kan selv skanne en hvilken som helst sekvens for slike degenererte mønstre — for eksempel GANTC, setet til HinfI.
Vanlige misforståelser
- “Samme gjenkjenningssete betyr samme enzym.” SmaI og XmaI leser begge
CCCGGG, men kutter det ulikt (stumpt kontra klebrig); gjenkjenningssekvensen alene forteller aldri kuttposisjonen. - “Bufferen og varmeinaktiveringsverdiene i databasen er lover.” De er typiske verdier fra leverandører; buffere varierer mellom leverandører, og noen enzymer krever spesielle forhold — sjekk alltid gjeldende datablad før en reaksjon settes opp.
- “Ingen kuttseter betyr at enzymet er ødelagt.” Oftere finnes setet, men er blokkert — bakteriell dam/dcm-metylering dekker GATC- og CCWGG-motiver og stopper flere enzymer (BclI er et klassisk offer).
Relaterte verktøy: Sekvensanalyse (GC-innhold og MW for DNA-et som kuttes), Primerdesigner (for å amplifisere fragmentet man vil ha) og Bio-kalkulatorer (hvor mye av spaltingen som skal lastes).
