Czym jest mol — i dlaczego każdy panel tej strony na nim działa?
Biologia molekularna wciąż zadaje jedno pytanie w różnych przebraniach: ile cząsteczek naprawdę mam? Waga pokazuje gramy, spektrofotometr absorbancję, pipeta mikrolitry — ale reakcje liczy się w molach, jednostce chemika równej 6,022×10²³ cząsteczek na mol. Masa cząsteczkowa (w daltonach, liczbowo tyle samo co g/mol) to kurs wymiany między tym, co można zważyć, a tym, co można policzyć. Każdy panel powyżej — MW, Masa↔Mole, OD260, Rozcieńczenie, Liczba kopii, Współczynnik ekstynkcji — to jeden krok tej wymiany.
Jedna liczba do zapamiętania: 1 µg dwuniciowego DNA o długości 1000 pz zawiera około 9,1×10¹¹ cząsteczek. To nie pomyłka — ilości, które się pipetuje, są w skali molekularnej astronomicznie duże, dlatego przeliczanie między masą, stężeniem a liczbą kopii ma takie znaczenie.
Masa, mole i molarność
Panel Masa↔Mole dzieli gramy przez g/mol, by otrzymać mole, a mole przez litry, by otrzymać molarność. Przykład: 1 mg białka o masie 50 kDa to 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mola = 20 nmol; rozpuszczone w 1 mL daje roztwór 20 µM. DNA genomowe często opisuje się w mikrogramach, oligonukleotydy i preparaty plazmidowe w pmol, a panel Konwersja jedn. przeskakuje między wszystkimi tymi prefiksami.
OD260: stężenie bez ważenia
Kwasy nukleinowe absorbują UV przy 260 nm zgodnie z prawem Beera–Lamberta (absorbancja = ekstynkcja × stężenie × długość drogi), więc spektrofotometr może zastąpić wagę. Dla drogi 1 cm jedna jednostka absorbancji odpowiada mniej więcej 50 µg/mL dwuniciowego DNA, 40 µg/mL RNA lub 33 µg/mL jednoniciowego DNA. Opcjonalny odczyt A280 daje heurystykę czystości: czyste DNA ma stosunek A260/A280 bliski 1,8, a czyste RNA bliski 2,0; niski stosunek zwykle oznacza białko lub fenol w próbce. Stosunek wyraźnie powyżej 1,8 w preparacie DNA wskazuje na odwrotność: RNA w próbce.
Rozcieńczanie: C₁V₁ = C₂V₂
Wzór na rozcieńczenie to po prostu zachowanie substancji: mole pobrane z roztworu zapasowego są równe molom dostarczonym. Aby przejść z roztworu zapasowego 100 mg/mL do 10 mg/mL w końcowej objętości 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL roztworu zapasowego plus 90 mL rozpuszczalnika, czyli rozcieńczenie 10-krotne. Panel Przygotowanie buforów wykonuje to samo działanie z czynnikami zapasu „50×” lub „10×” — przygotowanie 1 L 1× TAE z zapasu 50× wymaga 1000/50 = 20 mL zapasu.
Liczba kopii i współczynniki ekstynkcji
Ponieważ każda kopia plazmidu ma tę samą masę cząsteczkową (około 660 Da na parę zasad dsDNA), masa przelicza się na liczbę cząsteczek przez liczbę Avogadra: 1 µg plazmidu 5000 pz to mniej więcej 1,8×10¹¹ kopii, a 1 pmol czegokolwiek to 6,02×10¹¹ kopii. Dla białek metoda Edelhocha przewiduje absorbancję przy 280 nm z zaledwie trzech typów reszt: każdy tryptofan wnosi 5690 M⁻¹cm⁻¹, każda tyrozyna 1280, każda cystyna (mostek disiarczkowy) 120. Białko bez reszt aromatycznych jest prawie niewidoczne w UV — zważ je zamiast tego.
Częste nieporozumienia
- “OD 1 to dokładna stała.” Współczynniki 50/40/33 µg/mL to empiryczne średnie dla długich polimerów; skład zasad, sól, a zwłaszcza krótkie oligonukleotydy je przesuwają.
- “660 Da na parę zasad to prawo natury.” To wygodna średnia — DNA bogate w AT i GC różni się nieznacznie, a warunki soli mają znaczenie. Nie ufaj więcej niż dwóm cyfrom znaczącym.
- “A260/A280 równy 1,6 psuje mi próbkę.” Ten stosunek to heurystyka przesiewowa, wrażliwa na pH i bufor; traktuj go jako sygnał ostrzegawczy, a nie wyrok.
- “Kopie i pmol są wymienne.” Różnią się czynnikiem 6,02×10¹¹; pomylenie ich to klasyczny błąd przygotowania qPCR.
Powiązane narzędzia: Kalkulator masy molowej (chemiczny odpowiednik panelu MW), Roztwory i rozcieńczanie, Analiza sekwencji oraz Kalkulator genetyczny.
