Co właściwie oblicza analiza sekwencji DNA?
DNA to łańcuch czterech liter z dwiema kłopotliwymi cechami: dwie nici biegną w przeciwnych kierunkach, a komunikat da się odczytać tylko w blokach po trzy. Niemal każdy panel tej strony rozwiązuje jedną z tych dwóch kwestii — orientację nici (komplementarność odwrotna, transkrypcja) albo kod trójkowy (translacja, ramki odczytu). Pozostałe panele mierzą właściwości fizyczne (zawartość GC, temperaturę topnienia, masę cząsteczkową), które wynikają z samych liter.
Jedna liczba do zapamiętania: kod genetyczny ma 64 kodony (4×4×4), ale tylko 20 aminokwasów i sygnały stop — kod jest zdegenerowany, więc kilka różnych kodonów (np. CTT, CTC, CTA, CTG kodują wszystkie leucynę) zapisuje tę samą resztę. Ta nadmiarowość sprawia, że mutacja cicha może zmienić sekwencję bez zmiany białka.
Komplementarność odwrotna: odczytanie drugiej nici
Dwie nici DNA są antyrównoległe, a A paruje z T, C z G. Jeśli sekwencja jest na nici górnej, wszystko, co działa na nici dolnej (gen, miejsce wiązania startera, miejsce restrykcyjne), pojawia się jako komplementarność odwrotna: odwróć ciąg od końca do końca i zamień każdą zasadę na jej parę. Przykład: sekwencja 5′→3′ ATGCGT ma komplementarność odwrotną ACGCAT — a zastosowanie tej operacji dwa razy zawsze przywraca oryginał.
Transkrypcja i translacja
Transkrypcja kopiuje gen do RNA, zamieniając tyminę na uracyl. Translacja odczytuje następnie RNA (lub nić kodującą DNA) w kodonach po trzy zasady: ATG rozpoczyna białko (metionina), TAA/TAG/TGA je kończą. Ponieważ ramka odczytu może zaczynać się na pozycji 1, 2 lub 3 na dowolnej nici, każde dwuniciowe DNA daje sześć możliwych ramek — a zazwyczaj tylko jedna koduje prawdziwą, długą ramkę odczytu (ORF). Panel translacji pokazuje wszystkie sześć, dzięki czemu prawdziwy gen ujawnia się jako ramka z czystym odcinkiem od startu do stopu. Ponieważ polimeraza czyta nić matrycową, mRNA odpowiada nici kodującej, z U zamiast T.
Zawartość GC, Tm i masa cząsteczkowa
Pary GC mają trzy wiązania wodorowe wobec dwóch w parach AT, więc DNA bogate w GC jest stabilniejsze: topi się cieplej (wyższe Tm), utrzymuje ciaśniejsze fałdy, a w całych genomach jego udział jest sygnaturą gatunku i waha się od około 25% do 75% u bakterii. Masa cząsteczkowa sumuje masy poszczególnych nukleotydów (średnio około 330 Da dla DNA jednoniciowego, dwukrotnie więcej dla dupleksu z nicią komplementarną). Panel użycia kodonów zlicza, które z synonimicznych kodonów preferuje gen — silnie stronnicze użycie może zdradzać geny o wysokiej ekspresji.
Częste nieporozumienia
- “Komplementarność odwrotna to po prostu komplementarność.” Samo uzupełnienie daje ciąg 3′→5′; dopiero późniejsze odwrócenie przywraca konwencjonalną orientację 5′→3′, której używają polimerazy i podręczniki.
- “Kodon stop oznacza koniec genu.” W przypadkowej ramce kodony stop pojawiają się przypadkiem mniej więcej co 21 kodonów; prawdziwą ramkę odczytu (ORF) ocenia się po długości i właściwym starcie, a nie po jednym kodonie stop.
- “Zawartość GC to tylko procent.” Przewiduje też zachowanie przy przyłączaniu: projektowanie starterów PCR, sond i rygor hybrydyzacji opierają się na niej (zobacz Projektant starterów).
Powiązane narzędzia: Projektant starterów (Tm, dimery, sprawdzenie pary), Enzymy restrykcyjne (gdzie padają cięcia w tej samej sekwencji) oraz Kalkulatory biologiczne (masa, molarność i liczba kopii z wyników MW).
