Czym jest enzym restrykcyjny?
Enzym restrykcyjny to para molekularnych nożyczek, które bakterie wykształciły jako system odpornościowy: patroluje komórkę i tnie obcy DNA (zwykle wirusowy) wszędzie tam, gdzie pojawi się jedna konkretna krótka sekwencja, podczas gdy własne DNA bakterii jest chronione chemicznymi znacznikami. Enzymy restrykcyjne typu II, używane w biologii molekularnej, rozpoznają sekwencję 4–8 zasad i tną w określonym położeniu wewnątrz niej lub obok niej — nożyczki programowalne: wybiera się miejsce i dokładnie wiadomo, gdzie trafi cięcie.
Jedna liczba do zapamiętania: miejsce rozpoznawania długości 6 zasad, takie jak GAATTC EcoRI, pojawia się przypadkowo mniej więcej raz na 46 = 4096 pz losowego DNA. Dlatego trawienie genomu daje tysiące fragmentów, a trawienie małego plazmidu zwykle kilka — im krótsze DNA, tym mniej miejsc zawiera.
Miejsca rozpoznawania, lepkie i tępe końce
Większość miejsc typu II jest palindromowa: sekwencja czyta się tak samo na obu niciach (EcoRI czyta GAATTC niezależnie od tego, czy czyta się nić górną, czy dolną). EcoRI tnie między G a A, zostawiając jednoniciowe zwisy AATT — „lepkie” końce, które łączą się z każdym innym zwisem AATT. Enzymy takie jak SmaI (CCC^GGG) i EcoRV tną prosto przez obie nici i zostawiają tępe końce, które można połączyć z każdym innym tępym końcem, ale ligują znacznie słabiej. BamHI i BglII rozpoznają różne sekwencje, a mimo to zostawiają ten sam zwis GATC, więc ich fragmenty można połączyć, choć powstałe miejsce hybrydowe nie pasuje już do żadnego z tych enzymów. To właśnie sztuczka stojąca za klonowaniem modułowym.
Trawienie pojedyncze, podwójne, mapa fragmentów
Pojedyncze trawienie odpowiada na pytanie „gdzie ten enzym tnie moją sekwencję?”; fragmenty, które wypisuje, to prążki, które widać po elektroforezie w żelu. Podwójne trawienie tnie dwoma enzymami naraz — standardowy sposób mapowania plazmidu, bo połączony zestaw fragmentów wyznacza względne położenie miejsc każdego enzymu. Zauważ, że ten analizator traktuje wejście jako sekwencję liniową: cząsteczka liniowa z N miejscami cięcia daje N+1 fragmentów, podczas gdy plazmid kolisty z N miejscami daje dokładnie N fragmentów.
Zdegenerowane miejsca rozpoznawania
Niektóre enzymy rozpoznają pozycje tolerujące więcej niż jedną zasadę, zapisywane kodami IUPAC: BstEII rozpoznaje GGTNACC (N = dowolna zasada), StyI rozpoznaje CCWWGG (W = A lub T). Panel Wyszukiwanie miejsc przyjmuje ten sam alfabet, więc można samodzielnie przeszukać dowolną sekwencję pod kątem takich zdegenerowanych wzorców — na przykład GANTC, miejsce HinfI.
Częste nieporozumienia
- “To samo miejsce rozpoznawania oznacza ten sam enzym.” SmaI i XmaI rozpoznają oba
CCCGGG, ale tną je inaczej (tępo i lepko); sama sekwencja rozpoznawania nigdy nie mówi, gdzie leży miejsce cięcia. - “Wartości bufora i inaktywacji cieplnej z bazy to prawa.” To typowe wartości producentów; bufory różnią się między dostawcami, a niektóre enzymy potrzebują specjalnych warunków — zawsze sprawdź aktualną kartę techniczną przed przygotowaniem reakcji.
- “Brak miejsc cięcia oznacza, że enzym jest uszkodzony.” Częściej miejsce jest, ale zablokowane — metylacja dam/dcm bakterii pokrywa motywy GATC i CCWGG i blokuje kilka enzymów (BclI to klasyczna ofiara).
Powiązane narzędzia: Analiza sekwencji (zawartość GC i masa cząsteczkowa cięcia DNA), Projektant starterów (amplifikacja fragmentu, którego potrzeba) oraz Kalkulatory biologiczne (ile trawienia nałożyć na żel).
