Hvad beregner DNA-sekvensanalyse egentlig?
DNA er en kæde af fire bogstaver med to besværlige egenskaber: de to strenge løber i modsatte retninger, og budskabet kan kun læses i blokke af tre. Næsten alle paneler på denne side findes for at håndtere en af disse to kendsgerninger — strengorientering (omvendt komplement, transkription) eller tripletkoden (translation, læserammer). De øvrige paneler måler fysiske egenskaber (GC-indhold, smeltetemperatur, molekylvægt), der følger af selve bogstaverne.
Det ene tal at huske: den genetiske kode har 64 kodoner (4×4×4), men kun 20 aminosyrer plus stopsignaler — koden er degenereret, så flere forskellige kodoner (f.eks. CTT, CTC, CTA og CTG læses alle som leucin) angiver den samme rest. Denne redundans er grunden til, at en stille mutation kan ændre en sekvens uden at ændre et protein.
Omvendt komplement: at læse den anden streng
DNA's to strenge er antiparallelle, og A parrer med T, C med G. Hvis sekvensen står på den øverste streng, optræder alt, der virker på den nederste streng (et gen, et primerbindingssted, et restriktionssted), som det omvendte komplement: vend strengen fra ende til anden, og byt hver base ud med sin partner. Eksempel: 5′→3′-sekvensen ATGCGT har det omvendte komplement ACGCAT — og anvendes operationen to gange, får man altid det oprindelige tilbage.
Transkription og translation
Transkription kopierer et gen over i RNA og bytter thymin ud med uracil. Translation læser derefter RNA'en (eller DNA'ens kodende streng) i kodoner på tre baser: ATG starter et protein (methionin), og TAA/TAG/TGA stopper det. Fordi læserammen kan starte ved position 1, 2 eller 3 på begge strenge, tilbyder enhver dobbeltstrenget DNA seks mulige rammer — og typisk koder kun én for en reel, lang ORF (åben læseramme). Translationspanelet viser alle seks, så det sande gen træder frem som den ramme med et rent stykke fra start til stop. Fordi polymerasen læser skabelonstrengen, ender mRNA med at matche den kodende streng, med U i stedet for T.
GC-indhold, Tm og molekylvægt
GC-par deler tre hydrogenbindinger mod AT's to, så GC-rigt DNA er mere stabilt: det smelter varmere (højere Tm), holder fastere foldninger, og i hele genomer er dets andel et artskendetegn, der varierer fra cirka 25 % til 75 % på tværs af bakterier. Molekylvægten summerer masserne for hvert nukleotid (cirka 330 Da i gennemsnit for enkeltstrenget DNA, dobbelt for duplex med den komplementære streng). Kodonbrugspanelet tæller, hvilke af de synonyme kodoner et gen foretrækker — kraftigt skæv brug kan afsløre højt udtrykte gener.
Almindelige misforståelser
- “Det omvendte komplement er blot komplementet.” Komplementering alene giver en 3′→5′-streng; først når den også vendes, genoprettes den konventionelle 5′→3′-orientering, som polymeraser og lærebøger bruger.
- “Et stopkodon betyder slutningen af genet.” I en tilfældig læseramme optræder stopkodoner tilfældigt cirka hver 21. kodon; en ægte ORF bedømmes ud fra længde og en korrekt start, ikke ud fra et enkelt stop.
- “GC-indhold er blot en procentdel.” Det forudsiger også annealingadfærd: PCR-primerdesign, probedesign og hybridiseringsstringens støtter sig alle på det (se Primerdesigner).
Relaterede værktøjer: Primerdesigner (Tm, dimere, parkontrol), Restriktionsenzymer (hvor snittene falder i samme sekvens), og Biologiberegnere (masse, molaritet og kopital ud fra disse MW-resultater).
