Essentiële biochemische berekeningen — molecuulgewicht, omrekening van massa naar mol, bepaling van de concentratie via A260, C1V1-verdunning, kopieaantal, eiwitextinctiecoëfficiënt, bufferbereidingsrecepten en eenheidsconversie. Ook: Sequentieanalyse | Genetica-calculator.
Voer een DNA-/RNA-sequentie, eiwitsequentie (eenletterige code) of chemische formule in om het molecuulgewicht te berekenen.
Voer molecuulgewicht en massa in om mol te berekenen, of mol om de massa te berekenen die nodig is voor een doelvolume en concentratie.
Voer de A260-meting in om de concentratie van nucleïnezuur te berekenen. Voer optioneel de A280 in voor de zuiverheidsverhouding (A260/A280).
Gebruik de formule C₁V₁ = C₂V₂ om verdunningen te berekenen. Voer de concentratie van de voorraad, de doelconcentratie en het doelvolume in.
Voer de lengte van het template en de massa in om het aantal DNA-/RNA-kopieën te berekenen.
Voer een eiwitsequentie in om de extinctiecoëfficiënt bij 280 nm te berekenen met de methode van Edelhoch (bijdragen van Trp, Tyr, Cys).
×
Kies een buffer en voer het doelvolume in om het bereidingsrecept te krijgen.
Kies een categorie en eenheden om gangbare biochemische eenheidsconversies uit te voeren.
Referenties: A260-conversiefactoren: dsDNA=50 µg/mL, ssDNA=33 µg/mL, RNA=40 µg/mL per 1,0 OD. Gemiddeld nucleotide-MW: ~330 Da (dsDNA). Eiwitextinctie bij 280 nm: Trp=5690, Tyr=1280, Cys(Cystine)=120 M⁻¹cm⁻¹. Bufferrecepten gebaseerd op standaardprotocollen uit de moleculaire biologie (Sambrook & Russell).
Wat is een mol — en waarom draait elk paneel op deze pagina erom?
De moleculaire biologie stelt steeds dezelfde vraag in verschillende kostuums: hoeveel moleculen heb ik eigenlijk? Een weegschaal leest grammen, een spectrofotometer leest absorbantie, een pipet meet microliters — maar reacties tellen mol, de chemische eenheid van 6,022×10²³ moleculen per mol. Het molecuulgewicht (in dalton, numeriek gelijk aan g/mol) is de wisselkoers tussen wat u kunt wegen en wat u kunt tellen. Elk paneel hierboven — MG, massa↔mol, OD260, verdunning, kopieaantal, extinctiecoëfficiënt — is één stap op die wissel.
Het ene getal om te onthouden: 1 µg dubbelstrengs DNA van 1000 bp bevat ongeveer 9,1×10¹¹ moleculen. Geen typefout — de hoeveelheden die u pipetteert zijn op moleculaire schaal astronomisch groot, daarom is omrekenen tussen massa, concentratie en kopieaantal zo belangrijk.
Massa, mol en molariteit
Het paneel Massa↔mol deelt grammen door g/mol om mol te krijgen, en deelt mol door liters om molariteit te krijgen. Uitgewerkt voorbeeld: 1 mg van een eiwit van 50 kDa is 1×10−3 g ÷ 50.000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; opgelost in 1 mL is dat een oplossing van 20 µM. Genomisch DNA wordt vaak in microgram besproken, oligo's en plasmidepreparaten in pmol, en het paneel Eenheidsconversie schakelt tussen al deze voorvoegsels.
OD260: concentratie zonder wegen
Nucleïnezuren absorberen UV bij 260 nm volgens de wet van Beer–Lambert (absorbantie = extinctie × concentratie × weglengte), dus een spectrofotometer kan een weegschaal vervangen. Voor een weglengte van 1 cm komt één absorbantie-eenheid overeen met ongeveer 50 µg/mL dubbelstrengs DNA, 40 µg/mL RNA, of 33 µg/mL enkelstrengs DNA. De optionele A280-meting geeft een zuiverheidsheuristiek: zuiver DNA ligt rond een A260/A280-verhouding van 1,8 en zuiver RNA rond 2,0; een lage verhouding betekent meestal dat eiwit of fenol meelift. Een verhouding ruim boven 1,8 in een DNA-preparaat wijst de andere kant op: RNA dat meelift.
Verdunning: C₁V₁ = C₂V₂
De verdunningsformule is gewoon behoud van opgeloste stof: de mol die u uit de voorraad neemt, is gelijk aan de mol die u levert. Om van een voorraad van 100 mg/mL naar 10 mg/mL te gaan in een eindvolume van 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL voorraad plus 90 mL oplosmiddel, een 10-voudige verdunning. Het paneel Bufferbereiding voert dezelfde rekenkunde uit met voorraadfactoren als “50×” of “10×” — 1 L 1× TAE maken uit een 50×-voorraad kost 1000/50 = 20 mL voorraad.
Kopieaantal en extinctiecoëfficiënten
Omdat elke kopie van een plasmide hetzelfde molecuulgewicht heeft (ongeveer 660 Da per basepaar voor dsDNA), wordt massa via het getal van Avogadro omgerekend naar een aantal moleculen: 1 µg van een plasmide van 5000 bp is ruwweg 1,8×10¹¹ kopieën, en 1 pmol van iets is 6,02×10¹¹ kopieën. Voor eiwitten voorspelt de methode van Edelhoch de absorptie bij 280 nm uit slechts drie resttypen: elk tryptofaan levert 5690 M⁻¹cm⁻¹, elk tyrosine 1280, elk cystine (disulfidebrug) 120. Een eiwit zonder aromatische resten is nauwelijks zichtbaar voor UV — weeg het in plaats daarvan.
Veelvoorkomende misverstanden
“Een OD van 1 is een exacte constante.” De factoren 50/40/33 µg/mL zijn empirische gemiddelden voor lange polymeren; basissamenstelling, zout en vooral korte oligonucleotiden verschuiven ze.
“660 Da per basepaar is een natuurwet.” Het is een handig gemiddelde — AT- en GC-rijk DNA verschilt iets, en zoutomstandigheden doen ertoe. Vertrouw niet op meer dan twee significante cijfers.
“Een A260/A280 van 1,6 verpest mijn monster.” De verhouding is een screeningsheuristiek, gevoelig voor pH en buffer; behandel hem als een signaal, niet als een oordeel.
“Kopieën en pmol zijn uitwisselbaar.” Ze verschillen met een factor 6,02×10¹¹; ze door elkaar halen is een klassieke fout bij het opzetten van qPCR.
