Ce este un mol — și de ce funcționează fiecare panou de pe această pagină?
Biologia moleculară tot pune aceeași întrebare, în haine diferite: câte molecule am de fapt? O balanță arată grame, un spectrofotometru arată absorbanța, o pipetă măsoară microlitri — dar reacțiile numără moli, unitatea chimistului, de 6,022×10²³ molecule pe mol. Greutatea moleculară (în daltoni, numeric identică cu g/mol) este cursul de schimb între ceea ce poate fi cântărit și ceea ce poate fi numărat. Fiecare panou de mai sus — MW, Masă↔Moli, OD260, Diluție, Număr de copii, Coeficient de extincție — este un pas pe acest curs de schimb.
Singurul număr de reținut: 1 µg de ADN dublu catenar de 1000 pb conține aproximativ 9,1×10¹¹ molecule. Nu este o greșeală de tipar — cantitățile pipetate sunt uriașe la scară moleculară, de aceea conversia între masă, concentrație și număr de copii contează atât de mult.
Masă, moli și molaritate
Panoul Masă↔Moli împarte grame la g/mol ca să obțină moli și împarte moli la litri ca să obțină molaritatea. Exemplu lucrat: 1 mg de o proteină de 50 kDa este 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; dizolvat în 1 mL, rezultă o soluție de 20 µM. ADN-ul genomic se discută adesea în micrograme, oligonucleotidele și preparatele de plasmide în pmol, iar panoul Conversie unități trece între toți acești prefixe.
OD260: concentrație fără cântărire
Acizii nucleici absorb UV la 260 nm conform legii Beer–Lambert (absorbanță = extincție × concentrație × lungimea drumului optic), deci un spectrofotometru poate înlocui o balanță. Pentru o cale de 1 cm, o unitate de absorbanță corespunde aproximativ cu 50 µg/mL de ADN dublu catenar, 40 µg/mL de ARN sau 33 µg/mL de ADN monocatenar. Citirea opțională a A280 oferă o euristică a purității: un ADN curat are un raport A260/A280 în jur de 1,8, iar un ARN curat în jur de 2,0; un raport mic înseamnă de obicei că proteine sau fenol au rămas în probă. Un raport mult peste 1,8 într-o preparare de ADN indică invers: ARN rămas în probă.
Diluție: C₁V₁ = C₂V₂
Formula diluției este doar conservarea substanței dizolvate: moli scoși din soluția-mamă sunt egali cu moli prezenți în soluția finală. Pentru a trece de la o soluție-mamă de 100 mg/mL la 10 mg/mL într-un volum final de 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL de soluție-mamă plus 90 mL de solvent, o diluție de 10 ori. Panoul Preparare tampon rulează aceeași aritmetică cu factori de soluție-mamă de „50×” sau „10×” — pentru a face 1 L de TAE 1× dintr-o soluție-mamă de 50× sunt necesare 1000/50 = 20 mL de soluție-mamă.
Număr de copii și coeficienți de extincție
Întrucât fiecare copie a unei plasmide are aceeași greutate moleculară (aproximativ 660 Da pe pereche de baze pentru ADN dublu catenar), masa se convertește în număr de molecule prin numărul lui Avogadro: 1 µg dintr-o plasmidă de 5000 pb este aproximativ 1,8×10¹¹ copii, iar 1 pmol din orice este 6,02×10¹¹ copii. Pentru proteine, metoda Edelhoch prezice absorbanța la 280 nm din doar trei tipuri de reziduuri: fiecare triptofan contribuie cu 5690 M⁻¹cm⁻¹, fiecare tirozină cu 1280, fiecare cistină (punte disulfurică) cu 120. O proteină fără reziduuri aromatice este aproape invizibilă în UV — se cântărește în schimb.
Neînțelegeri frecvente
- „O DO de 1 este o constantă exactă.” Factorii de 50/40/33 µg/mL sunt medii empirice pentru polimeri lungi; compoziția bazelor, sarea și mai ales oligonucleotidele scurte îi deplasează.
- „660 Da pe pereche de baze este o lege a naturii.” Este o medie convenabilă — ADN-ul bogat în AT și cel bogat în GC diferă puțin, iar condițiile de sare contează. Nu se poate baza pe mai mult de două cifre semnificative.
- „Un raport A260/A280 de 1,6 îmi strică proba.” Raportul este o euristică de screening, sensibilă la pH și la tampon; se tratează ca un semnal de atenție, nu ca un verdict.
- „Copiile și pmol sunt interschimbabile.” Diferă printr-un factor de 6,02×10¹¹; confuzia dintre ele este o eroare clasică la prepararea qPCR.
Instrumente înrudite: Calculator de masă molară (gemenul chimic al panoului MW), Soluții și diluție, Analiza secvențelor și Calculator de genetică.
