Grundläggande biokemiska beräkningar — molekylvikt, omvandling från massa till mol, A260-koncentrationsbestämning, C1V1-spädning, kopietal, proteinets extinktionskoefficient, recept för buffertberedning och enhetsomvandling. Också: Sekvensanalys | Genetikkalkylatorn.
Ange en DNA/RNA-sekvens, en proteinsekvens (enbokstavskod) eller en kemisk formel för att beräkna molekylvikten.
Ange molekylvikt och massa för att beräkna mol, eller mol för att beräkna den massa som behövs för en målvolym och koncentration.
Ange A260-avläsningen för att beräkna nukleinsyrakoncentrationen. Ange valfritt A280 för renhetskvoten (A260/A280).
Använd formeln C₁V₁ = C₂V₂ för att beräkna spädningar. Ange stockkoncentration, målkoncentration och målvolym.
Ange mallängd och massa för att beräkna antalet DNA/RNA-kopior.
Ange en proteinsekvens för att beräkna extinktionskoefficienten vid 280 nm med Edelhoch-metoden (bidrag från Trp, Tyr, Cys).
×
Välj en buffert och ange målvolym för att få beredningsreceptet.
Välj en kategori och enheter för att göra vanliga biokemiska enhetsomvandlingar.
Referenser: A260-omvandlingsfaktorer: dsDNA=50 µg/mL, ssDNA=33 µg/mL, RNA=40 µg/mL per 1,0 OD. Genomsnittlig nukleotidvikt: ~330 Da (dsDNA). Proteinextinktion vid 280 nm: Trp=5690, Tyr=1280, Cys(cystin)=120 M⁻¹cm⁻¹. Buffertrecept baserade på standardprotokoll i molekylärbiologi (Sambrook & Russell).
Vad är en mol — och varför styr den varje panel på den här sidan?
Molekylärbiologi ställer hela tiden en fråga i olika skepnader: hur många molekyler har man egentligen? En våg mäter gram, en spektrofotometer mäter absorbans, en pipett mäter mikroliter — men reaktioner räknar mol, kemisternas enhet för 6,022×10²³ molekyler per mol. Molekylvikten (i dalton, numeriskt samma som g/mol) är växelkursen mellan det man kan väga och det man kan räkna. Varje panel ovan — MW, massa↔mol, OD260, spädning, kopietal, extinktionskoefficient — är ett steg i den växlingen.
Det enda talet att komma ihåg: 1 µg dubbelsträngat DNA med 1000 bp innehåller cirka 9,1×10¹¹ molekyler. Inte ett skrivfel — mängderna man pipetterar är astronomiskt stora på molekylär skala, vilket är varför omvandling mellan massa, koncentration och kopietal är så viktig.
Massa, mol och molaritet
Panelen Massa↔mol dividerar gram med g/mol för att få mol, och dividerar mol med liter för att få molaritet. Ett exempel: 1 mg av ett protein på 50 kDa är 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; löst i 1 mL blir det en 20 µM-lösning. Genomiskt DNA diskuteras ofta i mikrogram, oligos och plasmidpreparat i pmol, och panelen Enhetsomv. växlar mellan alla dessa prefix.
OD260: koncentration utan att väga
Nukleinsyror absorberar UV vid 260 nm enligt Beer–Lamberts lag (absorbans = extinktion × koncentration × väglängd), så en spektrofotometer kan ersätta en våg. För en väglängd på 1 cm motsvarar en absorbansenhet ungefär 50 µg/mL dubbelsträngat DNA, 40 µg/mL RNA eller 33 µg/mL enkelsträngat DNA. Den valfria A280-avläsningen ger en renhetsheuristik: rent DNA ligger nära en A260/A280-kvot på 1,8 och ren RNA nära 2,0; en låg kvot betyder oftast att protein eller fenol följer med. En kvot klart över 1,8 i ett DNA-preparat pekar åt det andra hållet: RNA följer med.
Spädning: C₁V₁ = C₂V₂
Spädningsformeln är bara bevarande av löst ämne: molerna man tar från stocken är lika med molerna man levererar. För att gå från en stock på 100 mg/mL till 10 mg/mL i en slutvolym på 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL stock plus 90 mL lösningsmedel, en tiofaldig spädning. Panelen Buffertberedning kör samma aritmetik med stockfaktorer på “50×” eller “10×” — för att göra 1 L 1× TAE från en 50×-stock behövs 1000/50 = 20 mL stock.
Kopietal och extinktionskoefficienter
Eftersom varje kopia av en plasmid har samma molekylvikt (cirka 660 Da per basenpar för dubbelsträngat DNA) omvandlas massa till antal molekyler via Avogadros tal: 1 µg av en plasmid på 5000 bp är cirka 1,8×10¹¹ kopior, och 1 pmol av vad som helst är 6,02×10¹¹ kopior. För proteiner förutsäger Edelhoch-metoden absorbans vid 280 nm utifrån bara tre typer av rester: varje tryptofan bidrar med 5690 M⁻¹cm⁻¹, varje tyrosin med 1280 och varje cystin (disulfid) med 120. Ett protein utan aromatiska rester är nästan osynligt för UV — väg det i stället.
Vanliga missuppfattningar
“Ett OD på 1 är en exakt konstant.” Faktorerna 50/40/33 µg/mL är empiriska medelvärden för långa polymerer; baskomposition, salt och särskilt korta oligonukleotider förskjuter dem.
“660 Da per basenpar är en naturlag.” Det är ett bekvämt medelvärde — DNA rikt på AT och GC skiljer sig något åt, och saltförhållandena spelar roll. Lita inte på mer än två signifikanta siffror.
“Ett A260/A280 på 1,6 förstör mitt prov.” Kvoten är en screeningheuristik, känslig för pH och buffert; betrakta den som en flagga, inte en dom.
“Kopior och pmol är utbytbara.” De skiljer sig med en faktor 6,02×10¹¹; att blanda ihop dem är ett klassiskt uppsättningsfel i qPCR.
