DNA- & proteinsekvensanalys

Analysera DNA-, RNA- och proteinsekvenser med omvänt komplement, transkription, translation i sex läsramar, GC-innehåll, smälttemperatur, molekylvikt och frekvens för kodonanvändning. Också: Primerdesigner | Restriktionsenzymer.

Ange en DNA-sekvens för att få dess omvända komplement (5'→3'). Stöder IUPAC-tvetydighetskoder.

Sekvensformat: Använd standardkoder för nukleotider enligt IUPAC: A, C, G, T (DNA) eller U (RNA). Tvetydighetskoder: R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, S=CG, W=AT, H=ACT, B=CGT, V=ACG, D=AGT, N=valfri. Sekvenser är skiftlägesokänsliga; mellanslag och siffror ignoreras.
Vad beräknar DNA-sekvensanalys egentligen?

DNA är en kedja av fyra bokstäver med två besvärliga egenskaper: de två strängarna löper i motsatta riktningar, och budskapet går bara att läsa i block om tre. Nästan varje panel på den här sidan finns för att hantera ett av dessa två fakta — strängorientering (omvänt komplement, transkription) eller tripletkoden (translation, läsramar). De återstående panelerna mäter fysikaliska egenskaper (GC-innehåll, smälttemperatur, molekylvikt) som följer av bokstäverna själva.

Det enda talet att komma ihåg: den genetiska koden har 64 kodoner (4×4×4) men bara 20 aminosyror plus stoppsignaler — koden är degenererad, så flera olika kodoner (t.ex. CTT, CTC, CTA, CTG läser alla leucin) anger samma rest. Den redundansen är varför en tyst mutation kan ändra en sekvens utan att ändra ett protein.
Omvänt komplement: att läsa den andra strängen

DNA:ts två strängar är antiparallella och A parar med T, C med G. Om sekvensen ligger på den övre strängen visas allt som fungerar på den undre strängen (en gen, en primers bindningsställe, ett restriktionsställe) som det omvända komplementet: vänd strängen från ände till ände och byt ut varje bas mot dess partner. Exempel: den 5′→3′-sekvensen ATGCGT har det omvända komplementet ACGCAT — och att tillämpa operationen två gånger ger alltid tillbaka originalet.

Transkription och translation

Transkription kopierar en gen till RNA och byter ut tymin mot uracil. Translation läser sedan RNA:t (eller DNA:ts kodande sträng) i kodoner om tre baser: ATG startar ett protein (metionin), TAA/TAG/TGA stoppar det. Eftersom läsramen kan börja på position 1, 2 eller 3 på vardera strängen har varje dubbelsträngat DNA sex möjliga ramar — och vanligtvis kodar bara en en verklig, lång ORF (öppen läsram). Translationspanelen visar alla sex så att den verkliga genen framträder som ramen med en ren sträcka från start till stopp. Eftersom polymeraset läser mallsträngen hamnar mRNA:t i överensstämmelse med den kodande strängen, med U i stället för T.

GC-innehåll, Tm och molekylvikt

GC-par delar tre vätebindningar mot ATs två, så GC-rikt DNA är stabilare: det smälter varmare (högre Tm), håller tätare veck och i hela genom är dess andel ett artsmärke som varierar från ungefär 25 % till 75 % bland bakterier. Molekylvikten summerar massorna för varje nukleotid (i genomsnitt cirka 330 Da för enkelsträngat DNA, dubbelt för dubbelsträngat med den komplementära strängen). Panelen Kodonanvändning räknar vilka av de synonyma kodonerna en gen föredrar — kraftigt snedvriden användning kan avslöja starkt uttryckta gener.

Vanliga missuppfattningar
  • “Det omvända komplementet är bara komplementet.” Att enbart komplettera ger en sträng 3′→5′; först när den även vänds återställs den konventionella orienteringen 5′→3′ som polymeraser och läroböcker använder.
  • “En stoppkodon betyder slutet på genen.” I en slumpmässig läsram uppträder stoppkodoner av en slump ungefär var 21:e kodon; en verklig ORF bedöms efter längd och en korrekt start, inte av en enskild stoppkodon.
  • “GC-innehåll är bara en procentsats.” Det förutsäger också glödgningsbeteende: primerdesign, sondesign och hybridiseringsstringens bygger alla på det (se Primerdesignern).

Relaterade verktyg: Primerdesignern (Tm, dimerer, parkontroll), Restriktionsenzymer (var snitten hamnar i samma sekvens) och Biokalkylatorer (massa, molaritet och kopietal utifrån dessa MW-resultat).