Vad är ett restriktionsenzym?
Ett restriktionsenzym är en slags molekylär sax som bakterier utvecklat som immunförsvar: det patrullerar cellen och klipper invaderande DNA (oftast från ett virus) där en viss kort sekvens förekommer, medan bakteriens eget DNA skyddas av kemiska märken. Typ II-restriktionsenzymer som används inom molekylärbiologi känner igen en sekvens på 4–8 baser och klipper på en definierad position i eller bredvid den — programmerbar sax: välj stället, och man vet exakt var klippet hamnar.
Det enda talet att komma ihåg: ett 6-baserat igenkänningsställe som EcoRI:s GAATTC förekommer av en slump ungefär var 46 = 4096 bp slumpmässigt DNA. Därför ger digestion av ett genom tusentals fragment, medan digestion av en liten plasmid oftast ger en handfull — ju kortare DNA, desto färre ställen bär det.
Igenkänningsställen, klibbiga ändar och trubbiga ändar
De flesta typ II-ställen är palindromiska: sekvensen läses likadant på båda strängarna (EcoRI läser GAATTC oavsett om man går längs den övre eller undre strängen). EcoRI klipper mellan G och A och lämnar enkelsträngade AATT-överhäng — “klibbiga” ändar som parar sig med vilket annat AATT-överhäng som helst. Enzymer som SmaI (CCC^GGG) och EcoRV klipper rakt över båda strängarna och lämnar trubbiga ändar, som kan kopplas till vilken annan trubbig ände som helst men ligerar betydligt ineffektivare. BamHI och BglII känner igen olika sekvenser men lämnar båda samma GATC-överhäng, så deras fragment kan ligeras ihop, även om det hybrida stället efteråt inte matchar något av enzymerna. BamHI och BglII klipper olika ställen men lämnar samma 5′-GATC-överhäng, så deras fragment ligerar — tricket bakom modulär kloning.
Enkel digestion, dubbel digestion, fragmentkarta
En enkel digestion svarar på frågan “var klipper detta enzym sekvensen?”; fragmenten den listar är vad man skulle se som band efter gelelektrofores. En dubbel digestion klipper med två enzymer samtidigt — standardsättet att kartlägga en plasmid, eftersom den kombinerade fragmentuppsättningen fixerar var varje enzyms ställen ligger i förhållande till varandra. Observera att analysatorn behandlar indata som en linjär sekvens: en linjär molekyl med N klippställen ger N+1 fragment, medan en cirkulär plasmid med N ställen ger exakt N fragment.
Degenererade igenkänningsställen
Vissa enzymer läser positioner som tolererar mer än en bas, skrivna med IUPAC-bokstäver: BstEII känner igen GGTNACC (N = valfri bas), StyI känner igen CCWWGG (W = A eller T). Panelen Sökning efter ställen tar emot samma alfabet, så man kan själv söka igenom valfri sekvens efter sådana degenererade mönster — till exempel GANTC, stället för HinfI.
Vanliga missuppfattningar
- “Samma igenkänningsställe betyder samma enzym.” SmaI och XmaI läser båda
CCCGGG men klipper det olika (trubbigt respektive klibbigt); igenkänningssekvensen ensam säger aldrig var klippet sker. - “Databasens buffert- och värmeinaktiveringsvärden är lagar.” De är typiska leverantörsvärden; buffertar skiljer sig mellan leverantörer och vissa enzymer kräver särskilda villkor — kontrollera alltid det aktuella produktbladet innan en reaktion sätts upp.
- “Inga klippställen betyder att enzymet är trasigt.” Oftare finns stället men är blockerat — bakteriell dam/dcm-metylering täcker GATC- och CCWGG-motiv och stoppar flera enzymer (BclI är ett klassiskt offer).
Relaterade verktyg: Sekvensanalys (GC-innehåll och MW för DNA:t som klipps), Primerdesignern (för att förstärka fragmentet man vill ha) och Biokalkylatorer (hur mycket av digestionen som ska laddas).
