Temel biyokimya hesaplamaları — molekül ağırlığı, kütleden mola dönüşüm, A260 ile derişim tayini, C1V1 seyreltmesi, kopya sayısı, protein sönüm katsayısı, tampon hazırlama tarifleri ve birim dönüşümü. Ayrıca: Dizi Analizi | Genetik Hesap Makinesi.
Molekül ağırlığını hesaplamak için bir DNA/RNA dizisi, protein dizisi (tek harf kodu) veya kimyasal formül girin.
Molü hesaplamak için molekül ağırlığını ve kütleyi, ya da belirli bir hacim ve derişim için gereken kütleyi hesaplamak üzere molü girin.
Nükleik asit derişimini hesaplamak için bir A260 okuması girin. İsteğe bağlı olarak saflık oranı (A260/A280) için A280 girin.
Seyreltmeleri hesaplamak için C₁V₁ = C₂V₂ formülünü kullanın. Stok derişimini, hedef derişimi ve hedef hacmi girin.
DNA/RNA kopya sayısını hesaplamak için şablon uzunluğunu ve kütleyi girin.
Edelhoch yöntemiyle (Trp, Tyr, Cys katkıları) 280 nm'deki sönüm katsayısını hesaplamak için bir protein dizisi girin.
×
Hazırlık tarifini almak için bir tampon seçin ve hedef hacmi girin.
Yaygın biyokimyasal birim dönüşümlerini yapmak için bir kategori ve birimler seçin.
Kaynaklar: A260 dönüşüm faktörleri: çift sarmallı DNA=50 µg/mL, tek sarmallı DNA=33 µg/mL, RNA=40 µg/mL, 1,0 OD başına. Ortalama nükleotid MA: yaklaşık 330 Da (çift sarmallı DNA). 280 nm'de protein sönümü: Trp=5690, Tyr=1280, Cys(Sistin)=120 M⁻¹cm⁻¹. Tampon tarifleri standart moleküler biyoloji protokollerine dayanır (Sambrook & Russell).
Mol nedir — ve neden bu sayfadaki her paneli çalıştırır?
Moleküler biyoloji aynı soruyu farklı kılıklarda sormaya devam eder: gerçekte kaç molekülüm var? Bir terazi gram okur, bir spektrofotometre absorbans okur, bir pipet mikrolitre ölçer — ama reaksiyonlar mol sayar, kimyacının mol başına 6,022×10²³ molekül birimi. Molekül ağırlığı (dalton cinsinden, sayısal olarak g/mol ile aynı) tartabildiklerinizle sayabildiklerinizin arasındaki döviz kurudur. Yukarıdaki her panel — MA, Kütle↔Mol, OD260, Seyreltme, Kopya Sayısı, Sönüm Katsayısı — o döviz kurunda bir adımdır.
Hatırlanması gereken tek sayı: 1000 bp çift sarmallı DNA'nın 1 µg'ı yaklaşık 9,1×10¹¹ molekül içerir. Yazım hatası değil — pipetle aldığınız miktarlar moleküler ölçekte astronomik büyüklüktedir, bu yüzden kütle, derişim ve kopya sayısı arasında dönüşüm yapmak bu kadar önemlidir.
Kütle, mol ve molarite
Kütle↔Mol paneli, mol elde etmek için gramı g/mol'e, molarite elde etmek için molü litreye böler. Çalışılmış örnek: 50 kDa'lık bir proteinin 1 mg'ı 1×10−3 g ÷ 50.000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol'dür; 1 mL'de çözüldüğünde 20 µM'lık bir çözelti olur. Genomik DNA sıklıkla mikrogram cinsinden, oligolar ve plazmit hazırlıkları pmol cinsinden tartışılır ve Birim Dönüşümü paneli tüm bu önekler arasında gidip gelir.
OD260: tartmadan derişim
Nükleik asitler, Beer–Lambert yasasına göre (absorbans = sönüm × derişim × yol uzunluğu) 260 nm'de UV emer, bu yüzden bir spektrofotometre bir terazinin yerini alabilir. 1 cm'lik bir yol için bir absorbans birimi, çift sarmallı DNA için yaklaşık 50 µg/mL, RNA için 40 µg/mL veya tek sarmallı DNA için 33 µg/mL'ye karşılık gelir. İsteğe bağlı A280 okuması bir saflık sezgiseli verir: temiz DNA'nın A260/A280 oranı 1,8 civarında, temiz RNA'nınki 2,0 civarındadır; düşük bir oran genellikle yanında protein veya fenol sürüklendiği anlamına gelir. Bir DNA hazırlığında 1,8'in çok üzerindeki bir oran tersini gösterir: yanında RNA sürüklenmiştir.
Seyreltme: C₁V₁ = C₂V₂
Seyreltme formülü yalnızca çözünen maddenin korunumudur: stoktan çektiğiniz mol, teslim ettiğiniz mole eşittir. 100 mL'lik son hacimde 100 mg/mL'lik bir stoktan 10 mg/mL'ye geçmek için: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL stok artı 90 mL çözücü, 10 kat seyreltme. Tampon Hazırlama paneli aynı aritmetiği “50×” veya “10×” stok faktörleriyle çalıştırır — 50× bir stoktan 1 L 1× TAE hazırlamak 1000/50 = 20 mL stok gerektirir.
Kopya sayısı ve sönüm katsayıları
Bir plazmitin her kopyasının aynı moleküler ağırlığa sahip olduğu için (çift sarmallı DNA için baz çifti başına yaklaşık 660 Da), kütle Avogadro sayısı üzerinden molekül sayısına dönüşür: 5000 bp'lik bir plazmitin 1 µg'ı yaklaşık 1,8×10¹¹ kopyadır ve herhangi bir şeyin 1 pmol'ü 6,02×10¹¹ kopyadır. Proteinler için Edelhoch yöntemi 280 nm'deki absorbansı yalnızca üç kalıntı türünden tahmin eder: her triptofan 5690 M⁻¹cm⁻¹, her tirozin 1280, her sistin (disülfit) 120 katkı sağlar. Aromatik kalıntısı olmayan bir protein UV için neredeyse görünmezdir — onu bunun yerine tartın.
Yaygın yanlış anlamalar
“1 OD tam bir sabittir.” 50/40/33 µg/mL faktörleri uzun polimerler için ampirik ortalamalardır; baz bileşimi, tuz ve özellikle kısa oligonükleotidler bunları kaydırır.
“Baz çifti başına 660 Da bir doğa yasasıdır.” Kullanışlı bir ortalamadır — AT ve GC açısından zengin DNA'lar hafifçe farklıdır ve tuz koşulları önemlidir. İkiden fazla anlamlı rakama güvenmeyin.
“A260/A280 değeri 1,6 numunemi bozar.” Oran bir tarama sezgiselidir, pH ve tampona duyarlıdır; bunu bir hüküm değil, bir işaret olarak değerlendirin.
“Kopya sayısı ve pmol birbirinin yerine kullanılabilir.” 6,02×10¹¹ katsayısı kadar farklıdırlar; bunları karıştırmak klasik bir qPCR kurulum hatasıdır.
