¿Qué es una enzima de restricción?
Una enzima de restricción es un par de tijeras moleculares que las bacterias desarrollaron como sistema inmunitario: patrulla la célula y corta el ADN invasor (normalmente de un virus) siempre que aparece una secuencia corta y concreta, mientras que el propio ADN de la bacteria queda protegido por marcas químicas. Las enzimas de restricción de tipo II que se usan en biología molecular reconocen una secuencia de 4 a 8 bases y cortan en una posición definida dentro de ella o junto a ella — unas tijeras programables: elija el sitio y sabrá exactamente dónde cae el corte.
El único número que conviene recordar: un sitio de reconocimiento de 6 bases, como el GAATTC de EcoRI, aparece por azar aproximadamente una vez cada 46 = 4096 pb de ADN aleatorio. Por eso digerir un genoma produce miles de fragmentos, pero digerir un plásmido pequeño suele producir unos pocos — cuanto más corto es el ADN, menos sitios contiene.
Sitios de reconocimiento, extremos cohesivos y extremos romos
La mayoría de los sitios de tipo II son palindrómicos: la secuencia se lee igual en las dos hebras (EcoRI lee GAATTC tanto si recorre la hebra superior como la inferior). EcoRI corta entre la G y la A, dejando salientes monocatenarios AATT — extremos “cohesivos” que se aparean con cualquier otro saliente AATT. Enzimas como SmaI (CCC^GGG) y EcoRV cortan en línea recta a través de ambas hebras y dejan extremos romos, que pueden unirse a cualquier otro extremo romo pero ligan mucho menos eficientemente. BamHI y BglII reconocen secuencias distintas pero dejan el mismo saliente GATC, así que sus fragmentos pueden ligarse entre sí, aunque el sitio híbrido no coincida después con ninguna de las dos enzimas. Es el truco que hay detrás de la clonación modular.
Digestión simple, digestión doble, mapa de fragmentos
Una digestión simple responde a “¿dónde corta esta enzima mi secuencia?”; los fragmentos que enumera son las bandas que vería tras una electroforesis en gel. Una digestión doble corta con dos enzimas a la vez — la forma estándar de mapear un plásmido, porque el conjunto combinado de fragmentos fija dónde están los sitios de cada enzima con respecto a los de la otra. Tenga en cuenta que este analizador trata la entrada como una secuencia lineal: una molécula lineal con N sitios de corte da N+1 fragmentos, mientras que un plásmido circular con N sitios da exactamente N fragmentos.
Sitios de reconocimiento degenerados
Algunas enzimas leen posiciones que toleran más de una base, escritas con letras IUPAC: BstEII reconoce GGTNACC (N = cualquier base), StyI reconoce CCWWGG (W = A o T). El panel de búsqueda de sitios acepta el mismo alfabeto, así que puede escanear cualquier secuencia en busca de esos patrones degenerados usted mismo — por ejemplo GANTC, el sitio de HinfI.
Malentendidos habituales
- “Mismo sitio de reconocimiento significa misma enzima.” SmaI y XmaI leen ambas
CCCGGG pero lo cortan de forma distinta (romo frente a cohesivo); la secuencia de reconocimiento por sí sola nunca indica la posición del corte. - “Los valores de tampón y de inactivación por calor de la base de datos son leyes.” Son valores típicos de los fabricantes; los tampones difieren entre proveedores y algunas enzimas necesitan condiciones especiales — compruebe siempre la hoja de datos vigente antes de preparar una reacción.
- “Sin sitios de corte, la enzima está rota.” Lo más frecuente es que el sitio esté ahí pero bloqueado: la metilación dam/dcm bacteriana cubre los motivos GATC y CCWGG y detiene varias enzimas (BclI es una víctima clásica).
Herramientas relacionadas: Análisis de secuencias (contenido en GC y PM del ADN que va a cortar), Diseño de cebadores (para amplificar el fragmento que quiere) y Calculadoras biológicas (cuánto digerido cargar).
