Calcolatori di biochimica — PM, massa⇄moli, OD260, diluizione, numero di copie, coefficiente di estinzione, preparazione di tamponi, conversione di unità
Calcolatori di biochimica
Calcoli essenziali di biochimica — peso molecolare, conversione da massa a moli, determinazione della concentrazione da A260, diluizione C1V1, numero di copie, coefficiente di estinzione delle proteine, ricette per la preparazione dei tamponi e conversione di unità. Vedi anche: Analisi delle sequenze | Calcolatore di genetica.
Inserisca una sequenza di DNA/RNA, una sequenza proteica (codice a una lettera) o una formula chimica per calcolare il peso molecolare.
Inserisca il peso molecolare e la massa per calcolare le moli, oppure le moli per calcolare la massa necessaria per un volume e una concentrazione finali.
Inserisca la lettura A260 per calcolare la concentrazione degli acidi nucleici. Facoltativamente inserisca A280 per il rapporto di purezza (A260/A280).
Usi la formula C₁V₁ = C₂V₂ per calcolare le diluizioni. Inserisca la concentrazione della soluzione madre, la concentrazione finale e il volume finale.
Inserisca la lunghezza del templato e la massa per calcolare il numero di copie di DNA/RNA.
Inserisca una sequenza proteica per calcolare il coefficiente di estinzione a 280 nm con il metodo di Edelhoch (contributi di Trp, Tyr e Cys).
×
Selezioni un tampone e inserisca il volume finale per ottenere la ricetta di preparazione.
Selezioni una categoria e le unità per eseguire le conversioni comuni di unità di biochimica.
Riferimenti: fattori di conversione A260: dsDNA=50 µg/mL, ssDNA=33 µg/mL, RNA=40 µg/mL per 1,0 OD. PM medio dei nucleotidi: circa 330 Da (dsDNA). Estinzione delle proteine a 280 nm: Trp=5690, Tyr=1280, Cys (cistina)=120 M⁻¹cm⁻¹. Ricette dei tamponi basate sui protocolli standard di biologia molecolare (Sambrook & Russell).
Cos'è una mole — e perché guida ogni pannello di questa pagina?
La biologia molecolare pone sempre la stessa domanda con abiti diversi: quante molecole ho davvero? Una bilancia misura grammi, uno spettrofotometro misura l'assorbanza, una pipetta misura microlitri — ma le reazioni contano le moli, l'unità del chimico di 6,022×10²³ molecole per mole. Il peso molecolare (in dalton, numericamente uguale a g/mol) è il tasso di cambio tra ciò che si può pesare e ciò che si può contare. Ogni pannello qui sopra — PM, Massa↔Moli, OD260, Diluizione, Numero di copie, Coefficiente di estinzione — è un passo di questo scambio.
Il numero da ricordare: 1 µg di DNA a doppio filamento da 1000 bp contiene circa 9,1×10¹¹ molecole. Non è un errore di battitura — le quantità che si pipettano sono astronomiche su scala molecolare, ed è per questo che convertire tra massa, concentrazione e numero di copie è così importante.
Massa, moli e molarità
Il pannello Massa↔Moli divide i grammi per g/mol per ottenere le moli, e divide le moli per i litri per ottenere la molarità. Esempio svolto: 1 mg di una proteina da 50 kDa è 1×10−3 g ÷ 50.000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; disciolte in 1 mL, si ottiene una soluzione 20 µM. Il DNA genomico si esprime spesso in microgrammi, gli oligonucleotidi e le preparazioni di plasmidi in pmol, e il pannello Conv. unità passa da un prefisso all'altro.
OD260: concentrazione senza pesare
Gli acidi nucleici assorbono i raggi UV a 260 nm secondo la legge di Lambert-Beer (assorbanza = estinzione × concentrazione × cammino ottico), quindi uno spettrofotometro può sostituire la bilancia. Per un cammino di 1 cm, un'unità di assorbanza corrisponde a circa 50 µg/mL di DNA a doppio filamento, 40 µg/mL di RNA o 33 µg/mL di DNA a singolo filamento. La lettura facoltativa di A280 fornisce un indicatore di purezza: un DNA pulito ha un rapporto A260/A280 vicino a 1,8, un RNA pulito vicino a 2,0; un rapporto basso di solito significa che proteine o fenolo sono rimasti nel campione. Un rapporto ben superiore a 1,8 in una preparazione di DNA indica il contrario: RNA residuo.
Diluizione: C₁V₁ = C₂V₂
La formula di diluizione è semplicemente la conservazione del soluto: le moli prelevate dalla soluzione madre equivalgono alle moli consegnate. Per passare da una soluzione madre di 100 mg/mL a 10 mg/mL in un volume finale di 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL di soluzione madre più 90 mL di solvente, una diluizione 10 volte. Il pannello Preparazione tampone esegue la stessa aritmetica con fattori di soluzione madre «50×» o «10×» — per preparare 1 L di TAE 1× da una soluzione 50× servono 1000/50 = 20 mL di soluzione madre.
Numero di copie e coefficienti di estinzione
Poiché ogni copia di un plasmide ha lo stesso peso molecolare (circa 660 Da per coppia di basi nel DNA a doppio filamento), la massa si converte in numero di molecole tramite il numero di Avogadro: 1 µg di un plasmide da 5000 bp corrisponde a circa 1,8×10¹¹ copie, e 1 pmol di qualsiasi sostanza equivale a 6,02×10¹¹ copie. Per le proteine, il metodo di Edelhoch prevede l'assorbanza a 280 nm a partire da soli tre tipi di residui: ogni triptofano contribuisce con 5690 M⁻¹cm⁻¹, ogni tirosina con 1280, ogni cistina (ponte disolfuro) con 120. Una proteina senza residui aromatici è quasi invisibile ai raggi UV — la pesi invece.
Incomprensioni comuni
«Un OD di 1 è una costante esatta.» I fattori 50/40/33 µg/mL sono medie empiriche per polimeri lunghi; la composizione delle basi, il sale e soprattutto gli oligonucleotidi corti li modificano.
«660 Da per coppia di basi è una legge di natura.» È una media comoda — il DNA ricco di AT e quello ricco di GC differiscono un po', e le condizioni saline contano. Non si fidi di più di due cifre significative.
«Un A260/A280 di 1,6 rovina il mio campione.» Il rapporto è un indicatore di screening, sensibile al pH e al tampone; lo consideri un segnale d'allarme, non un verdetto.
«Copie e pmol sono intercambiabili.» Differiscono di un fattore 6,02×10¹¹; confonderli è un classico errore nella preparazione della qPCR.
