Che cosa calcola davvero l'analisi di una sequenza di DNA?
Il DNA è una catena di quattro lettere con due proprietà scomode: i due filamenti corrono in direzioni opposte, e il messaggio è leggibile solo a blocchi di tre. Quasi ogni pannello di questa pagina serve a gestire uno di questi due aspetti — l'orientamento dei filamenti (complemento inverso, trascrizione) o il codice a triplette (traduzione, frame di lettura). I pannelli rimanenti misurano proprietà fisiche (contenuto di GC, temperatura di fusione, peso molecolare) che derivano dalle lettere stesse.
Il numero da ricordare: il codice genetico ha 64 codoni (4×4×4) ma solo 20 amminoacidi più gli stop — il codice è degenerato, quindi diversi codoni (ad esempio CTT, CTC, CTA, CTG codificano tutti la Leucina) indicano lo stesso residuo. Questa ridondanza spiega perché una mutazione silente può cambiare una sequenza senza cambiare la proteina.
Complemento inverso: leggere l'altro filamento
I due filamenti del DNA sono antiparalleli, e A si appaia con T, C con G. Se la sua sequenza è sul filamento superiore, tutto ciò che funziona sul filamento inferiore (un gene, un sito di legame di un primer, un sito di restrizione) compare come complemento inverso: si inverte la stringa da un capo all'altro e si sostituisce ogni base con la sua partner. Esempio: la sequenza 5′→3′ ATGCGT ha come complemento inverso ACGCAT — e applicare l'operazione due volte restituisce sempre l'originale.
Trascrizione e traduzione
La trascrizione copia un gene in RNA, sostituendo la timina con l'uracile. La traduzione legge poi l'RNA (o il filamento codificante del DNA) a gruppi di tre basi, detti codoni: ATG avvia una proteina (Metionina), TAA/TAG/TGA la terminano. Poiché il frame di lettura può iniziare alla posizione 1, 2 o 3 su entrambi i filamenti, qualsiasi DNA a doppio filamento offre sei frame possibili — e di solito solo uno codifica un ORF (open reading frame) reale e lungo. Il pannello di traduzione mostra tutti e sei, così il gene vero si rivela come il frame con un tratto pulito dall'inizio alla fine. Poiché la polimerasi legge il filamento stampo, l'mRNA risulta uguale al filamento codificante con U al posto di T.
Contenuto di GC, Tm e peso molecolare
Le coppie GC hanno tre legami idrogeno contro i due delle coppie AT, quindi il DNA ricco di GC è più stabile: fonde a temperatura più alta (Tm più alta), mantiene ripiegamenti più stretti, e nei genomi completi la sua quota è una firma della specie che varia da circa il 25% al 75% nei batteri. Il peso molecolare somma le masse dei singoli nucleotidi (circa 330 Da in media per il DNA a singolo filamento, il doppio per il duplex con il filamento complementare). Il pannello Uso dei codoni conta quale dei codoni sinonimi preferisce un gene — un uso fortemente sbilanciato può rivelare i geni molto espressi.
Incomprensioni comuni
- «Il complemento inverso è solo il complemento.» Il solo complemento dà una stringa 3′→5′; soltanto invertirla dopo ripristina l'orientamento convenzionale 5′→3′ usato dalle polimerasi e dai libri di testo.
- «Un codone di stop significa la fine del gene.» In un frame casuale gli stop compaiono per caso ogni ~21 codoni; un ORF genuino si valuta dalla lunghezza e da un inizio corretto, non da un singolo stop.
- «Il contenuto di GC è solo una percentuale.» Prevede anche il comportamento di appaiamento: la progettazione dei primer per PCR, delle sonde e la stringenza dell'ibridazione dipendono tutte da esso (vedi Progettazione di primer).
Strumenti correlati: Progettazione di primer (Tm, dimeri, verifica della coppia), Enzimi di restrizione (dove cadono i tagli nella stessa sequenza) e Calcolatori biologici (massa, molarità e numero di copie a partire da questi risultati di PM).
