Cos'è un primer per PCR?
Un primer è un breve frammento di DNA a singolo filamento (di solito 18–30 basi) che indica alla DNA polimerasi dove iniziare la copia. La polimerasi non può iniziare un filamento dal nulla — può soltanto estendere un'estremità 3′ già esistente — quindi nella PCR due primer fiancheggiano il bersaglio: il primer forward avvia la copia di un filamento, il primer reverse avvia la copia dell'altro, e insieme definiscono esattamente quale tratto del templato viene amplificato un miliardo di volte. Quasi tutte le proprietà che un primer deve avere derivano da un solo compito: aderire nel posto giusto, abbastanza fortemente, e in nessun altro punto.
Il numero da ricordare: imposti la temperatura di appaiamento circa 3–5°C sotto la temperatura di fusione (Tm) del primer. A Tm metà dei duplex primer-templato sono fusi; qualche grado in meno sposta l'equilibrio verso il legame, mentre qualche grado in più lo sposta verso il non legame del tutto.
Tm: tre calcolatori, tre risposte oneste
La temperatura di fusione dipende dalla composizione delle basi, dalla lunghezza, dal sale e dalla concentrazione del primer, e la pagina la calcola in tre modi. La regola di base (Wallace) — 2°C per ogni A/T più 4°C per ogni G/C — è una stima a mano che funziona solo per oligonucleotidi fino a circa 14 basi. La versione con correzione per il sale tiene conto dell'effetto stabilizzante del sodio. Il metodo SantaLucia dei vicini più prossimi somma i valori termodinamici misurati per ogni coppia di basi adiacenti, ed è quello di cui fidarsi per la pianificazione reale di una PCR; è anche il motivo per cui due primer con lo stesso contenuto di GC possono avere Tm diverse — contano i vicini impilati, non solo i conteggi. Per lo stesso motivo i tre metodi della Tm non concordano: la regola di base ignora sale e lunghezza, mentre la termodinamica dei vicini più prossimi tiene conto di entrambi.
Contenuto di GC e pinza GC in 3′
Le coppie GC hanno tre legami idrogeno contro i due delle coppie AT, quindi i primer ricchi di GC fondono a temperatura più alta. Il punto ideale è tra il 40 e il 60% di GC: molto meno e il primer lega debolmente; molto di più e lega troppo fortemente, anche in punti leggermente sbagliati. Una G o una C come ultima base all'estremità 3′ («pinza GC») ancora la posizione esatta da cui la polimerasi deve partire — una base terminale 3′ non corrispondente blocca l'estensione molto più di un mismatch al centro, quindi un ancoraggio 3′ solido rende meno produttivo l'appaiamento errato.
Dimeri e forcine: il primer che si attacca a sé stesso
Ogni primer la cui sequenza si appaia in parte con sé stessa o con il suo partner può sprecare reagenti: i dimeri omologhi (due copie dello stesso primer che si appaiano), gli eterodimeri (forward che si appaia al reverse) e le forcine (una molecola che si ripiega su sé stessa). Il danno è massimo quando l'appaiamento raggiunge un'estremità 3′, perché la polimerasi estende volentieri i dimeri di primer, sottraendo primer e producendo la caratteristica striscia di piccole bande spurie. Il pannello Verifica coppia raccoglie questi rischi in un unico rapporto — differenza di Tm, intervallo di GC, lunghezza del cross-dimer e complementarità in 3′.
Incomprensioni comuni
- «Una Tm alta significa un primer migliore.» La Tm dice soltanto quanto è caldo il duplex; la specificità deriva dall'unicità nel templato e dall'assenza di dimeri.
- «I due primer devono avere la stessa composizione di sequenza.» Devono avere Tm compatibili (entro circa 5°C); il contenuto di GC può legittimamente differire.
- «Ogni G o C nelle ultime cinque basi è una pinza GC.» Solo la base terminale è la pinza; troppe G e C in tutta la regione 3′ favoriscono invece un appaiamento non specifico.
Strumenti correlati: Analisi delle sequenze (calcoli prima la Tm e il GC della regione templato), Enzimi di restrizione (per aggiungere un sito di clonazione all'estremità 5′ del primer) e Calcolatori biologici (per risospendere il primer e convertirlo in µM).
