Cos'è un enzima di restrizione?
Un enzima di restrizione è un paio di forbici molecolari che i batteri hanno evoluto come sistema immunitario: pattuglia la cellula e taglia il DNA invasore (di solito di un virus) ovunque compaia una specifica breve sequenza, mentre il DNA del batterio è protetto da segni chimici. Gli enzimi di restrizione di tipo II usati in biologia molecolare riconoscono una sequenza di 4–8 basi e tagliano in una posizione definita al suo interno o accanto ad essa — forbici programmabili: scelga il sito e saprà esattamente dove cade il taglio.
Il numero da ricordare: un sito di riconoscimento di 6 basi, come il GAATTC dell'EcoRI, compare per caso circa una volta ogni 46 = 4096 bp di DNA casuale. Per questo digerire un genoma produce migliaia di frammenti, mentre digerire un piccolo plasmide ne produce di solito una manciata — più il DNA è corto, meno siti contiene.
Siti di riconoscimento, estremità coesive ed estremità piatte
La maggior parte dei siti di tipo II è palindromica: la sequenza si legge uguale su entrambi i filamenti (l'EcoRI legge GAATTC sia che si scorra sul filamento superiore sia su quello inferiore). L'EcoRI taglia tra la G e la A, lasciando sporgenze a singolo filamento AATT — estremità «coesive» che si appaiano con qualsiasi altra sporgenza AATT. Enzimi come SmaI (CCC^GGG) e EcoRV tagliano dritto attraverso entrambi i filamenti e lasciano estremità piatte, che possono unirsi a qualsiasi altra estremità piatta ma con un'efficienza molto minore. BamHI e BglII riconoscono sequenze diverse, ma lasciano la stessa sporgenza GATC, quindi i loro frammenti possono essere legati insieme anche se il sito ibrido non corrisponde più a nessuno dei due enzimi. BamHI e BglII tagliano siti diversi ma lasciano la stessa sporgenza 5′-GATC, quindi i loro frammenti si legano — il trucco alla base della clonazione modulare.
Digestione singola, digestione doppia, mappa dei frammenti
Una digestione singola risponde a «dove taglia questo enzima la mia sequenza?»; i frammenti che elenca sono ciò che si vedrebbe come bande dopo elettroforesi su gel. Una digestione doppia taglia con due enzimi contemporaneamente — il metodo standard per mappare un plasmide, perché l'insieme combinato dei frammenti fissa la posizione dei siti di ciascun enzima rispetto agli altri. Si noti che questo analizzatore tratta l'input come sequenza lineare: una molecola lineare con N siti di taglio dà N+1 frammenti, mentre un plasmide circolare con N siti dà esattamente N frammenti.
Siti di riconoscimento degenerati
Alcuni enzimi leggono posizioni che tollerano più di una base, scritte con le lettere IUPAC: il BstEII riconosce GGTNACC (N = qualsiasi base), lo StyI riconosce CCWWGG (W = A o T). Il pannello Ricerca di siti accetta lo stesso alfabeto, quindi può cercare da sé tali pattern degenerati in qualsiasi sequenza — ad esempio GANTC, il sito dell'HinfI.
Incomprensioni comuni
- «Stesso sito di riconoscimento significa stesso enzima.» SmaI e XmaI leggono entrambi
CCCGGG ma lo tagliano in modo diverso (piatto contro coesivo); la sola sequenza di riconoscimento non indica mai la posizione del taglio. - «I valori del tampone e dell'inattivazione termica nel database sono leggi.» Sono valori tipici dei fornitori; i tamponi differiscono tra i fornitori e alcuni enzimi richiedono condizioni particolari — verifichi sempre la scheda tecnica aggiornata prima di preparare una reazione.
- «Nessun sito di taglio significa che l'enzima è rotto.» Più spesso il sito c'è ma è bloccato: la metilazione dam/dcm dei batteri interessa i motivi GATC e CCWGG e blocca diversi enzimi (il BclI è una vittima classica).
Strumenti correlati: Analisi delle sequenze (contenuto GC e PM del DNA che sta tagliando), Progettazione di primer (per amplificare il frammento desiderato) e Calcolatori biologici (quanto digerito caricare).
