制限酵素とは何か？
制限酵素は、細菌が免疫機構として進化させた分子ハサミのペアです。細胞内をパトロールして、特定の短い配列が現れるどこでも侵入 DNA（多くはウイルス由来）を切断します。細菌自身の DNA は化学修飾によって保護されています。分子生物学で使う タイプ II 制限酵素は 4〜8 塩基の配列を認識し、その配列の中または隣の決まった位置で切断します — いわばプログラマブルなハサミです：サイトを選べば、どこで切れるかが正確にわかります。
覚えておきたい数字：EcoRI の GAATTC のような 6 塩基の認識サイトは、ランダム DNA 中に平均して 46 = 4096 bp に一度しか現れません。だからゲノムを消化すると何千もの断片が生じるのに対し、小さなプラスミドなら通常少数の断片で済みます — DNA が短いほど切断サイトは少なくなります。
認識サイト、粘着末端と平滑末端
タイプ II の認識サイトの多くは回文構造です。配列は両方の鎖で同じに読めます（EcoRI は上鎖でも下鎖でも GAATTC）。EcoRI は G と A の間で切り、一本鎖の AATT オーバーハング — 他の AATT オーバーハングとアニーリングできる「粘着」末端 — を残します。SmaI（CCC^GGG）や EcoRV のような酵素は両鎖をまっすぐ切断して平滑末端を残します。平滑末端は他の平滑末端と連結できますが、ライゲーション効率はずっと低くなります。BamHI と BglII は異なる配列を認識するのに同じ GATC オーバーハングを残すため、ハイブリッドサイトがその後どちらの酵素にも一致しなくなっても、両者の断片を連結できます。BamHI と BglII は別々のサイトを切りますが同じ 5′-GATC オーバーハングを残すので断片同士がライゲートする — モジュラークローニングの基礎となるテクニックです。
シングル/ダブルダイジェストと断片マップ
シングルダイジェストは「この酵素はどこで切るか」に答えます。表示される断片は、ゲル電気泳動後に見えるバンドそのものです。ダブルダイジェストは 2 種類の酵素で同時に切断します — プラスミドをマッピングする標準的な方法で、合わせた断片の集合が各酵素のサイトの相対位置を確定できるからです。注意：このアナライザーは入力を線状配列として扱います。線状分子では N カ所の切断サイトから N+1 個の断片が生じるのに対し、環状プラスミドでは N カ所からちょうど N 個の断片が生じます。
縮退した認識サイト
複数の塩基を許容する位置を読む酵素もあり、IUPAC 文字で書かれます。BstEII は GGTNACC（N = 任意の塩基）を、StyI は CCWWGG（W = A または T）を認識します。サイト検索パネルは同じ記法を受け付けるので、こうした縮退パターンを任意の配列について自分で走査できます — 例えば HinfI のサイト GANTC など。
よくある誤解
- 「同じ認識サイト＝同じ酵素」 SmaI と XmaI はどちらも
CCCGGG を読みますが、切り方が違います（平滑 vs 粘着）。認識配列だけでは切断位置はわかりません。
- 「データベースのバッファーと熱不活化の値は絶対」 これらは代表的なメーカー値です。バッファーはメーカーごとに異なり、特殊な条件が必要な酵素もあります — 反応を組む前に必ず最新のデータシートを確認してください。
- 「切断サイトがない＝酵素が壊れている」 多くの場合、サイトは存在するのにブロックされています — 細菌の dam/dcm メチル化は GATC と CCWGG モチーフを修飾し、いくつかの酵素（BclI が典型的な犠牲者）の切断を妨げます。
関連ツール：配列解析（切断する DNA の GC 含量と分子量）、プライマーデザイナー（目的断片の増幅）、バイオ計算（消化産物をどれだけロードするか）。
