O que é uma mole — e porque é que ela percorre todos os painéis desta página?
A biologia molecular faz sempre a mesma pergunta com roupagens diferentes: quantas moléculas tenho realmente? Uma balança lê gramas, um espectrofotómetro lê absorvância, uma pipeta mede microlitros — mas as reações contam moles, a unidade do químico de 6,022×10²³ moléculas por mole. O peso molecular (em daltons, numericamente igual a g/mol) é a taxa de câmbio entre o que se pode pesar e o que se pode contar. Cada painel acima — PM, massa⇄moles, OD260, diluição, número de cópias, coeficiente de extinção — é um passo nesse câmbio.
O número a reter: 1 µg de ADN de cadeia dupla de 1000 pb contém cerca de 9,1×10¹¹ moléculas. Não é um erro de digitação — as quantidades que pipetamos são astronomicamente grandes à escala molecular, e é por isso que converter entre massa, concentração e número de cópias importa tanto.
Massa, moles e molaridade
O painel massa⇄moles divide gramas por g/mol para obter moles, e divide moles por litros para obter a molaridade. Exemplo resolvido: 1 mg de uma proteína de 50 kDa é 1×10−3 g ÷ 50 000 g/mol = 2×10−8 mol = 20 nmol; dissolvido em 1 mL, dá uma solução de 20 µM. O ADN genómico costuma falar-se em microgramas, os oligos e as preparações de plasmídeo em pmol, e o painel de conversão de unidades passa entre todos estes prefixos.
OD260: concentração sem pesar
Os ácidos nucleicos absorvem UV a 260 nm segundo a lei de Beer–Lambert (absorvância = extinção × concentração × comprimento do percurso), por isso um espectrofotómetro pode substituir a balança. Para um percurso de 1 cm, uma unidade de absorvância corresponde a cerca de 50 µg/mL de ADN de cadeia dupla, 40 µg/mL de ARN, ou 33 µg/mL de ADN de cadeia simples. A leitura opcional a 280 nm dá uma heurística de pureza: o ADN limpo fica perto de um rácio A260/A280 de 1,8 e o ARN limpo perto de 2,0; um rácio baixo significa normalmente proteína ou fenol a acompanhar. Um rácio bem acima de 1,8 numa preparação de ADN aponta para o lado oposto: ARN a acompanhar.
Diluição: C₁V₁ = C₂V₂
A fórmula de diluição é apenas a conservação do soluto: as moles que retira do stock são iguais às moles que entrega. Para passar de um stock de 100 mg/mL para 10 mg/mL num volume final de 100 mL: V₁ = (10 × 100) / 100 = 10 mL de stock mais 90 mL de solvente, uma diluição de 10 vezes. O painel de preparação de tampões faz a mesma aritmética com fatores de stock de « 50× » ou « 10× » — fazer 1 L de TAE 1× a partir de um stock de 50× exige 1000/50 = 20 mL de stock.
Número de cópias e coeficientes de extinção
Como cada cópia de um plasmídeo tem o mesmo peso molecular (cerca de 660 Da por par de bases para ADN de cadeia dupla), a massa converte-se em número de moléculas através do número de Avogadro: 1 µg de um plasmídeo de 5000 pb são cerca de 1,8×10¹¹ cópias, e 1 pmol de qualquer coisa são 6,02×10¹¹ cópias. Para proteínas, o método de Edelhoch prevê a absorvância a 280 nm a partir de apenas três tipos de resíduos: cada triptofano contribui com 5690 M⁻¹cm⁻¹, cada tirosina com 1280, cada cistina (ponte dissulfeto) com 120. Uma proteína sem resíduos aromáticos é quase invisível ao UV — pese-a em vez disso.
Ideias erradas comuns
- « Uma DO de 1 é uma constante exata. » Os fatores 50/40/33 µg/mL são médias empíricas para polímeros longos; a composição de bases, o sal e sobretudo os oligonucleótidos curtos deslocam-nos.
- « 660 Da por par de bases é uma lei da natureza. » É uma média conveniente — o ADN rico em AT e o rico em GC diferem ligeiramente, e as condições de sal importam. Não confie em mais de dois algarismos significativos.
- « Um A260/A280 de 1,6 estraga a minha amostra. » O rácio é uma heurística de triagem, sensível ao pH e ao tampão; trate-o como um sinal de alerta, não como um veredicto.
- « Cópias e pmol são intermutáveis. » Diferem por um fator de 6,02×10¹¹; confundi-los é um erro clássico de montagem de qPCR.
Ferramentas relacionadas: Calculadora de massa molar (a gémea química do painel PM), Soluções e diluição, Análise de sequências e Calculadora de genética.
