O que calcula, afinal, a análise de sequências de ADN?
O ADN é uma cadeia de quatro letras com duas propriedades incómodas: as duas cadeias correm em sentidos opostos, e a mensagem só é legível em blocos de três. Quase todos os painéis desta página existem para lidar com um desses dois factos — a orientação das cadeias (complemento reverso, transcrição) ou o código de tripletos (tradução, grelhas de leitura). Os painéis restantes medem propriedades físicas (teor de GC, temperatura de fusão, peso molecular) que decorrem das próprias letras.
O número a reter: o código genético tem 64 códons (4×4×4) mas apenas 20 aminoácidos mais os stops — o código é degenerado, pelo que vários códons diferentes (p. ex. CTT, CTC, CTA, CTG leem todos Leucina) soletram o mesmo resíduo. Essa redundância é a razão pela qual uma mutação silenciosa pode alterar uma sequência sem alterar uma proteína.
Complemento reverso: ler a outra cadeia
As duas cadeias do ADN são antiparalelas e A emparelha com T, C com G. Se a sua sequência está na cadeia de cima, tudo o que funciona na cadeia de baixo (um gene, um sítio de ligação de primer, um sítio de restrição) aparece como o complemento reverso: inverta a cadeia de ponta a ponta e troque cada base pela sua parceira. Exemplo: a sequência 5′→3′ ATGCGT tem como complemento reverso ACGCAT — e aplicar a operação duas vezes devolve sempre o original.
Transcrição e tradução
A transcrição copia um gene para ARN, trocando a timina pelo uracilo. A tradução lê depois o ARN (ou a cadeia codificante do ADN) em códons de três bases: ATG inicia uma proteína (Metionina), TAA/TAG/TGA terminam-na. Como a grelha de leitura pode começar na posição 1, 2 ou 3 em qualquer das cadeias, qualquer ADN de cadeia dupla oferece seis grelhas possíveis — e normalmente só uma codifica uma ORF real e longa (grelha aberta de leitura). O painel de tradução mostra as seis para que o gene verdadeiro se revele como a grelha com um troço limpo do início ao stop. Como a polimerase lê a cadeia molde, o ARNm acaba por coincidir com a cadeia codificante, com U no lugar de T.
Teor de GC, Tm e peso molecular
Os pares GC partilham três ligações de hidrogénio contra as duas dos AT, por isso o ADN rico em GC é mais estável: funde a temperaturas mais altas (Tm mais elevada), mantém dobras mais apertadas, e em genomas inteiros a sua proporção é uma assinatura da espécie que vai de cerca de 25% a 75% entre bactérias. O peso molecular soma as massas por nucleótido (cerca de 330 Da em média para ADN de cadeia simples, o dobro para o duplex com a cadeia complementar). O painel de uso de códons conta quais dos códons sinónimos um gene prefere — um uso muito enviesado pode expor genes muito expressos.
Erros comuns
- « O complemento reverso é apenas o complemento. » Complementar sozinho dá uma cadeia 3′→5′; só inverter depois restaura a orientação convencional 5′→3′ que as polimerases e os manuais usam.
- « Um códon de paragem significa o fim do gene. » Numa grelha aleatória, os stops aparecem ao acaso cerca de a cada 21 códons; uma ORF genuína avalia-se pelo comprimento e por um início adequado, não por um único stop.
- « O teor de GC é apenas uma percentagem. » Também prevê o comportamento de emparelhamento: o desenho de primers de PCR, de sondas e a rigidez da hibridação dependem dele (ver o Desenho de primers).
Ferramentas relacionadas: Desenho de primers (Tm, dímeros, verificação de pares), Enzimas de restrição (onde caem os cortes na mesma sequência) e Calculadoras bio (massa, molaridade e número de cópias a partir destes resultados de PM).
