O que é um primer de PCR?
Um primer é um pequeno fragmento de ADN de cadeia simples (tipicamente 18–30 bases) que indica à ADN polimerase onde começar a copiar. A polimerase não consegue iniciar uma cadeia a partir do nada — só consegue estender uma extremidade 3′ existente — por isso, na PCR, dois primers flanqueiam o alvo: o primer direto inicia a cópia de uma cadeia, o primer reverso inicia a cópia da outra, e juntos definem exatamente que troço do molde é amplificado um bilião de vezes. Quase todas as propriedades que um primer deve ter decorrem de uma só tarefa: colar-se no sítio certo, com força suficiente, e em mais lado nenhum.
O número a reter: defina a temperatura de emparelhamento cerca de 3–5 °C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do primer. Na Tm metade dos duplex primer-molde estão fundidos; uns graus abaixo puxam o equilíbrio para a ligação, e uns graus acima puxam-no para a não-ligação.
Tm: três calculadoras, três respostas honestas
A temperatura de fusão depende da composição de bases, do comprimento, do sal e da concentração do primer, e a página calcula-a de três maneiras. A regra básica (Wallace) — 2 °C por A/T mais 4 °C por G/C — é uma estimativa manual que só funciona para oligos até cerca de 14 bases. A versão ajustada ao sal corrige o efeito estabilizador do sódio. O método de vizinhos mais próximos de SantaLucia soma os valores termodinâmicos medidos para cada par de bases adjacentes, e é o que se deve confiar para planear uma PCR real; é também por isso que dois primers com o mesmo teor de GC podem ter Tm diferentes — importam os vizinhos empilhados, não apenas as contagens. É também por isso que os três métodos de Tm discordam: a regra básica ignora o sal e o comprimento, enquanto a termodinâmica de vizinhos mais próximos tem em conta ambos.
Teor de GC e o grampo GC na extremidade 3′
Os pares GC mantêm três ligações de hidrogénio contra as duas dos AT, por isso os primers ricos em GC fundem a temperaturas mais altas. O ponto ideal é 40–60% de GC: muito menos e o primer liga-se fracamente; muito mais e liga-se em excesso, incluindo a sítios ligeiramente errados. Uma G ou C como última base na extremidade 3′ (« grampo GC ») ancora a posição exata onde a polimerase tem de começar — uma base terminal 3′ não emparelhada bloqueia a extensão muito mais do que um desemparelhamento no meio, por isso uma âncora firme em 3′ torna a iniciação errada menos produtiva.
Dímeros e grampos de cabelo: o primer a atacar-se a si próprio
Qualquer primer cuja sequência emparelhe parcialmente consigo próprio ou com o seu parceiro pode desperdiçar reagente: autodímeros (duas cópias do mesmo primer a emparelharem), heterodímeros (o direto a emparelhar com o reverso) e grampos de cabelo (uma molécula que se dobra sobre si própria). O dano é pior quando o emparelhamento chega a uma extremidade 3′, porque a polimerase estende alegremente os dímeros de primers, roubando primer e produzindo o clássico esfregaço de bandas minúsculas de lixo. O painel de verificação de pares reúne estes riscos num só relatório — diferença de Tm, intervalo de GC, comprimento do cruzamento de dímeros e complementaridade em 3′.
Erros comuns
- « Um Tm alto significa um primer melhor. » A Tm só diz quão quente é o duplex; a especificidade vem da unicidade no molde e da ausência de dímeros.
- « Os dois primers têm de ter a mesma composição de sequência. » Têm de ter Tm compatível (dentro de cerca de 5 °C); o teor de GC pode legitimamente diferir.
- « Qualquer G ou C nas últimas cinco bases é um grampo GC. » Só a base terminal é o grampo; ter GC em excesso em toda a região 3′ promove, pelo contrário, iniciações não específicas.
Ferramentas relacionadas: Análise de sequências (calcule primeiro a Tm e o GC da região do molde), Enzimas de restrição (acrescente um sítio de clonagem à extremidade 5′ do primer) e Calculadoras bio (ressuspenda o primer e converta para µM).
