O que é uma enzima de restrição?
Uma enzima de restrição é um par de tesouras moleculares que as bactérias evoluíram como sistema imunitário: patrulha a célula e corta o ADN invasor (normalmente de um vírus) sempre que aparece uma sequência curta específica, enquanto o próprio ADN da bactéria fica protegido por marcas químicas. As enzimas de restrição do Tipo II usadas em biologia molecular reconhecem uma sequência de 4 a 8 bases e cortam numa posição definida dentro dela ou ao lado dela — tesouras programáveis: escolhe-se o sítio e sabe-se exatamente onde cai o corte.
O número a reter: um sítio de reconhecimento de 6 bases, como o GAATTC da EcoRI, aparece ao acaso cerca de uma vez em cada 46 = 4096 pb de ADN aleatório. É por isso que digerir um genoma produz milhares de fragmentos, mas digerir um pequeno plasmídeo costuma produzir meia dúzia — quanto mais curto o ADN, menos sítios transporta.
Sítios de reconhecimento, extremidades coesivas e extremidades romas
A maioria dos sítios do Tipo II é palindrómica: a sequência lê-se igual nas duas cadeias (a EcoRI lê GAATTC quer percorra a cadeia de cima quer a de baixo). A EcoRI corta entre o G e o A, deixando saliências de cadeia simples AATT — extremidades « coesivas » que se emparelham com qualquer outra saliência AATT. Enzimas como a SmaI (CCC^GGG) e a EcoRV cortam diretamente através das duas cadeias e deixam extremidades romas, que se podem unir a qualquer outra extremidade romba mas ligam-se muito menos eficientemente. A BamHI e a BglII reconhecem sequências diferentes, mas deixam a mesma saliência GATC, por isso os seus fragmentos podem ser ligados entre si, mesmo que o sítio híbrido já não coincida com nenhuma das duas enzimas. Esse é o truque por trás da clonagem modular.
Digestão simples, digestão dupla, mapa de fragmentos
Uma digestão simples responde à pergunta « onde é que esta enzima corta a minha sequência? »; os fragmentos que lista são o que se veria como bandas após electroforese em gel. Uma digestão dupla corta com duas enzimas ao mesmo tempo — a forma padrão de mapear um plasmídeo, porque o conjunto combinado de fragmentos fixa a posição dos sítios de cada enzima uns em relação aos outros. Note que este analisador trata a entrada como uma sequência linear: uma molécula linear com N sítios de corte dá N+1 fragmentos, ao passo que um plasmídeo circular com N sítios dá exatamente N fragmentos.
Sítios de reconhecimento degenerados
Algumas enzimas leem posições que toleram mais do que uma base, escritas com letras IUPAC: a BstEII reconhece GGTNACC (N = qualquer base), a StyI reconhece CCWWGG (W = A ou T). O painel de pesquisa de sítios aceita o mesmo alfabeto, por isso pode procurar por si esses padrões degenerados em qualquer sequência — por exemplo GANTC, o sítio da HinfI.
Erros comuns
- « O mesmo sítio de reconhecimento significa a mesma enzima. » A SmaI e a XmaI leem ambas
CCCGGG, mas cortam-no de forma diferente (romo vs. coesivo); a sequência de reconhecimento sozinha nunca diz a posição do corte. - « Os valores de tampão e de inativação por calor da base de dados são leis. » São valores típicos dos fornecedores; os tampões diferem entre fornecedores e algumas enzimas precisam de condições especiais — confirme sempre a ficha técnica atual antes de montar uma reação.
- « Se não há sítios de corte, a enzima está avariada. » Com mais frequência o sítio está lá mas bloqueado — a metilação bacteriana dam/dcm sobrepõe-se aos motivos GATC e CCWGG e trava várias enzimas (a BclI é uma baixa clássica).
Ferramentas relacionadas: Análise de sequências (teor de GC e PM do ADN que está a cortar), Desenho de primers (amplificar o fragmento que quer) e Calculadoras bio (quanto da digestão carregar no gel).
