Ce este o enzimă de restricție?
O enzimă de restricție este o pereche de foarfece moleculare pe care bacteriile le-au dezvoltat ca sistem imunitar: patrulează celula și taie ADN-ul invadator (de obicei de la un virus) oriunde apare o secvență scurtă specifică, în timp ce ADN-ul propriu al bacteriei este protejat prin marcaje chimice. Enzimele de restricție de tip II folosite în biologia moleculară recunosc o secvență de 4–8 baze și taie într-o poziție definită în interiorul ei sau alături de ea — foarfece programabile: se alege situsul și se știe exact unde ajunge tăietura.
Singurul număr de reținut: un sit de recunoaștere de 6 baze, precum GAATTC al EcoRI, apare din întâmplare aproximativ o dată la fiecare 46 = 4096 pb de ADN aleatoriu. De aceea digestia unui genom produce mii de fragmente, dar digestia unei plasmide mici produce de obicei câteva — cu cât ADN-ul este mai scurt, cu atât conține mai puține situsuri.
Situsuri de recunoaștere, capete lipicioase și capete plate
Majoritatea siturilor de tip II sunt palindromice: secvența se citește la fel pe ambele catene (EcoRI citește GAATTC indiferent dacă parcurgi catena de sus sau cea de jos). EcoRI taie între G și A, lăsând capete monocatenare AATT — capete „lipicioase” care se pot alipi de orice alt capăt AATT. Enzime precum SmaI (CCC^GGG) și EcoRV taie drept prin ambele catene și lasă capete plate, care pot fi unite cu orice alt capăt plat, dar ligatează mult mai puțin eficient. BamHI și BglII recunosc secvențe diferite, dar lasă același capăt GATC, deci fragmentele lor pot fi ligate între ele, chiar dacă situsul hibrid nu se potrivește niciuneia dintre enzime după aceea. BamHI și BglII taie situsuri diferite, dar lasă același capăt 5′-GATC, deci fragmentele lor se ligatează — trucul din spatele clonării modulare.
Digestie simplă, digestie dublă, harta fragmentelor
O digestie simplă răspunde la întrebarea „unde taie enzima aceasta secvența?”; fragmentele listate sunt cele care s-ar vedea ca benzi după electroforeza pe gel. O digestie dublă taie cu două enzime deodată — modul standard de a face harta unei plasmide, deoarece setul combinat de fragmente stabilește poziția siturilor fiecărei enzime față de celelalte. De reținut este că analizorul tratează intrarea ca o secvență liniară: o moleculă liniară cu N situsuri de tăiere dă N+1 fragmente, în timp ce o plasmidă circulară cu N situsuri dă exact N fragmente.
Situsuri de recunoaștere degenerate
Unele enzime citesc poziții care tolerează mai mult de o bază, notate cu litere IUPAC: BstEII recunoaște GGTNACC (N = orice bază), StyI recunoaște CCWWGG (W = A sau T). Panoul Căutare de situsuri acceptă același alfabet, astfel încât oricine poate scana singur orice secvență pentru asemenea modele degenerate — de exemplu GANTC, situsul lui HinfI.
Neînțelegeri frecvente
- „Același sit de recunoaștere înseamnă aceeași enzimă.” SmaI și XmaI citesc amândouă
CCCGGG, dar îl taie diferit (plat vs. lipicios); secvența de recunoaștere singură nu spune niciodată poziția tăieturii.
- „Valorile din baza de date pentru tampon și inactivarea prin căldură sunt legi.” Sunt valori tipice ale furnizorilor; tampoanele diferă între furnizori, iar unele enzime au nevoie de condiții speciale — se verifică întotdeauna fișa tehnică actuală înainte de a pregăti o reacție.
- „Lipsa siturilor de tăiere înseamnă că enzima este defectă.” Cel mai adesea situsul există, dar este blocat: metilarea bacteriană dam/dcm acoperă motivele GATC și CCWGG și oprește mai multe enzime (BclI este o victimă clasică).
Instrumente înrudite: Analiza secvențelor (conținutul GC și greutatea moleculară a ADN-ului care se taie), Proiectant de primeri (pentru amplificarea fragmentului dorit) și Calculatoare bio (câtă digestie să se încarce).
