Restriksiyon enzimi nedir?
Restriksiyon enzimi, bakterilerin bir bağışıklık sistemi olarak evrimleşmiş bir moleküler makas çiftidir: hücreyi devriye gezer ve belirli bir kısa dizi göründüğü her yerde istilacı DNA'yı (genellikle bir virüsten) keser, bakterinin kendi DNA'sı ise kimyasal işaretlerle korunur. Moleküler biyolojide kullanılan Tip II restriksiyon enzimleri 4–8 bazlık bir dizi tanır ve bunun içinde veya yanında tanımlı bir konumda keser — programlanabilir makaslar: bölgeyi seçersiniz, kesimin tam nereye düştüğünü bilirsiniz.
Hatırlanması gereken tek sayı: EcoRI'nin GAATTC gibi 6 bazlı bir tanıma bölgesi, rastgele DNA'da kabaca her 46 = 4096 bp'de bir rastlantısal olarak görünür. Bu yüzden bir genomu kesmek binlerce parça üretirken küçük bir plazmiti kesmek genellikle bir avuç parça üretir — DNA ne kadar kısaysa, o kadar az bölge taşır.
Tanıma bölgeleri, yapışkan uçlar ve körelmiş uçlar
Tip II bölgelerinin çoğu palindromiktir: dizi her iki ipliğde de aynı okunur (EcoRI, üst veya alt ipliği takip etseniz de GAATTC okur). EcoRI G ile A arasında keser ve tek iplikli AATT çıkıntıları bırakır — herhangi bir başka AATT çıkıntısına eşleşen “yapışkan” uçlar. SmaI (CCC^GGG) ve EcoRV gibi enzimler iki ipliği de düz kesip körelmiş uçlar bırakır; bunlar herhangi bir başka körelmiş uca eklenebilir ama çok daha az verimli ligasyon yapar. BamHI ve BglII farklı dizileri tanır ama ikisi de aynı GATC çıkıntısını bırakır, bu yüzden parçaları birbirine bağlanabilir — melez bölge sonradan iki enzimin de tanımasını sağlamasa bile. BamHI ve BglII farklı bölgeleri keser ama aynı 5′-GATC çıkıntısını bırakır, bu yüzden parçaları ligasyona girer — modüler klonlamanın arkasındaki numara budur.
Tekli kesim, ikili kesim, parça haritası
Tekli kesim, “bu enzim dizimi nerede kesiyor?” sorusunu yanıtlar; listelediği parçalar jel elektroforezinden sonra görülecek bantlardır. İkili kesim iki enzimle aynı anda keser — bir plazmiti haritalamanın standart yoludur, çünkü birleşik parça kümesi her enzimin bölgelerinin birbirine göre nerede durduğunu sabitler. Bu analizcinin girdiyi doğrusal bir dizi olarak ele aldığını unutmayın: N kesim bölgesi olan doğrusal bir molekül N+1 parça verir, oysa N bölgesi olan dairesel bir plazmit tam olarak N parça verir.
Dejenere tanıma bölgeleri
Bazı enzimler birden fazla bazı kabul eden konumları okur ve bunlar IUPAC harfleriyle yazılır: BstEII GGTNACC'yi tanır (N = herhangi bir baz), StyI CCWWGG'yi tanır (W = A veya T). Bölge Arama paneli aynı alfabeyi kabul eder, bu yüzden herhangi bir diziyi bu dejenere örüntüler için kendiniz tarayabilirsiniz — örneğin HinfI'in bölgesi olan GANTC.
Yaygın yanlış anlamalar
- “Aynı tanıma bölgesi aynı enzim demektir.” SmaI ve XmaI ikisi de
CCCGGG okur ama farklı keser (körelmiş ve yapışkan); tanıma dizisi tek başına kesim konumunu asla söylemez. - “Veritabanındaki tampon ve ısıyla inaktivasyon değerleri yasadır.” Bunlar tipik üretici değerleridir; tamponlar tedarikçiler arasında farklılık gösterir ve bazı enzimler özel koşullar ister — bir reaksiyon kurmadan önce her zaman güncel teknik föyü kontrol edin.
- “Kesim bölgesi yoksa enzim bozuktur.” Çoğu zaman bölge oradadır ama bloke edilmiştir: bakteriyel dam/dcm metilasyonu GATC ve CCWGG motiflerini kaplar ve birkaç enzimi durdurur (BclI klasik bir kurbandır).
İlgili araçlar: Dizi Analizi (kestiğiniz DNA'nın GC içeriği ve MA), Primer Tasarımcısı (istediğiniz parçayı çoğaltmak için) ve Biyo Hesap Makineleri (kesimden ne kadarının yükleneceği için).
