Аналізатор рестриктаз

Аналіз послідовностей ДНК рестриктазами — одинарне і подвійне розщеплення, аналіз рестрикційних фрагментів, перегляд бази з понад 60 ферментів типу II і пошук сайтів рестрикції за кодами IUPAC. Також: Аналіз послідовностей | Конструктор праймерів.

Введіть послідовність ДНК і оберіть рестриктазу, щоб знайти всі сайти розрізу та довжини фрагментів, що утворюються.

Коди неоднозначності IUPAC: R=A|G, Y=C|T, M=A|C, K=G|T, S=C|G, W=A|T, H=A|C|T, B=C|G|T, V=A|C|G, D=A|G|T, N=будь-яка. Дані ферментів зібрано з опублікованої літератури та публічних баз даних.
Що таке рестриктаза?

Рестриктаза — це пара молекулярних ножиць, яку бактерії виробили як імунну систему: вона патрулює клітину і ріже чужорідну ДНК (зазвичай від вірусу) там, де з'являється одна специфічна коротка послідовність, тоді як власна ДНК бактерії захищена хімічними позначками. Ферменти типу II, які використовують у молекулярній біології, розпізнають послідовність із 4–8 основ і ріжуть у визначеній позиції всередині неї або поруч — ножиці, які можна програмувати: оберіть сайт, і ви точно знаєте, де пройде розріз.

Одне число, яке варто запам'ятати: 6-основний сайт розпізнавання, як GAATTC у EcoRI, трапляється випадково приблизно раз на кожні 46 = 4096 пар основ випадкової ДНК. Тому розщеплення геному дає тисячі фрагментів, а розщеплення малої плазміди зазвичай — жменьку: що коротша ДНК, то менше сайтів вона містить.
Сайти розпізнавання, липкі й тупі кінці

Більшість сайтів типу II паліндромні: послідовність читається однаково на обох ланцюгах (EcoRI читає GAATTC, куди б ви не дивилися — на верхньому чи нижньому ланцюзі). EcoRI ріже між G і A, залишаючи одноланцюгові виступи AATT — «липкі» кінці, які з'єднуються з будь-яким іншим виступом AATT. Ферменти на зразок SmaI (CCC^GGG) і EcoRV ріжуть прямо через обидва ланцюги і залишають тупі кінці, які можна з'єднати з будь-яким іншим тупим кінцем, але лігують значно менш ефективно. BamHI і BglII розпізнають різні послідовності, але обидва залишають однаковий виступ GATC, тож їхні фрагменти можна з'єднати, навіть якщо гібридний сайт після цього не відповідає жодному з ферментів. Саме цей трюк лежить в основі модульного клонування.

Одинарне розщеплення, подвійне розщеплення, карта фрагментів

Одинарне розщеплення відповідає на запитання «де цей фермент ріже мою послідовність?»; фрагменти, які він перелічує, — це смуги, які ви побачите після гель-електрофорезу. Подвійне розщеплення ріже двома ферментами одночасно — стандартний спосіб картографувати плазміду, бо сукупний набір фрагментів фіксує, де сайти кожного ферменту розташовані один відносно одного. Зауважте, що цей аналізатор трактує вхід як лінійну послідовність: лінійна молекула з N сайтами розрізу дає N+1 фрагмент, тоді як кругла плазміда з N сайтами дає рівно N фрагментів.

Вироджені сайти розпізнавання

Деякі ферменти читають позиції, які допускають більше ніж одну основу, — записані літерами IUPAC: BstEII розпізнає GGTNACC (N — будь-яка основа), StyI розпізнає CCWWGG (W — A або T). Панель пошуку сайтів приймає той самий алфавіт, тож ви самі можете шукати такі вироджені шаблони в будь-якій послідовності — наприклад, GANTC, сайт HinfI.

Поширені хибні уявлення
  • “Той самий сайт розпізнавання — той самий фермент.” SmaI і XmaI обидва читають CCCGGG, але ріжуть його по-різному (тупо проти липко); сама послідовність розпізнавання ніколи не каже вам позиції розрізу.
  • “Значення буфера й теплової інактивації з бази — закони.” Це типові значення постачальників; буфери різняться між постачальниками, а деяким ферментам потрібні особливі умови — завжди звіряйтеся з чинним паспортом перед постановкою реакції.
  • “Відсутність сайтів розрізу означає, що фермент зламаний.” Частіше сайт є, але заблокований: бактеріальне метилювання dam/dcm накладається на мотиви GATC і CCWGG і зупиняє кілька ферментів (BclI — класична жертва).

Пов'язані інструменти: Аналіз послідовностей (вміст GC і MW ДНК, яку ви розрізаєте), Конструктор праймерів (ампліфікація потрібного фрагмента) і Біо-калькулятори (скільки розщеплення вносити).